水稻減數分裂期高溫對苯丙烷類代謝及下游分支代謝途徑的影響

汪勝勇 陳宇航 陳會麗 黃鈺杰 張嘯天 丁雙成 王宏偉

水稻減數分裂期高溫對苯丙烷類代謝及下游分支代謝途徑的影響

汪勝勇1陳宇航1陳會麗1黃鈺杰1張嘯天1丁雙成2,*王宏偉1,*

[1農業農村部長江中游作物綠色高效生產重點實驗室(部省共建)/長江大學農學院，湖北 荊州 434025；2濕地生態與農業利用教育部工程研究中心/長江大學農學院，湖北 荊州 434025；*通信聯系人，email: shchding@yangtzeu.edu.cn; wanghw@yangtzeu.edu.cn]

【目的】探究水稻減數分裂期高溫如何影響苯丙烷類代謝，并分析其與水稻耐熱性的關系。【方法】以N22、廣陸矮15、SDWG005、全兩優681、Y兩優900、Y兩優1號、兩優培九和綿恢101(MH101)等8種耐熱和不耐熱水稻品種為試驗材料，設置常溫和高溫處理，分析減數分裂期高溫脅迫對水稻的花粉活力與苯丙烷類代謝關鍵酶活性、木質素、總黃酮及總酚等主要代謝產物含量之間的相關性；并進一步選擇極端耐高溫的SDWG005和極端不耐高溫的MH101為材料分析苯丙烷類代謝、碳水化合物代謝和抗氧化系統對水稻耐熱性的影響。【結果】1) 與對照相比，高溫顯著降低水稻花粉活力和穎花受精率，不同的水稻品種受高溫影響后，花粉活力和穎花受精率的降幅不同。2) 高溫顯著增加穎花中肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶活性以及木質素、總黃酮和總酚的含量，且耐熱品種增幅高于敏感品種。3) 高溫下花粉活力與肉桂酸-4-羥化酶活性、木質素含量顯著相關，穎花受精率與木質素含量以及木質素含量與類黃酮含量極顯著相關。4) 與MH101相比，SDWG005小穗穎殼中木質素受高溫顯著誘導積累，且高溫下能夠維持較高細胞壁過氧化物酶活性。5) 與MH101相比，SDWG005穎花在高溫下能夠維持較高過氧化物酶、超氧化物歧化酶和抗壞血酸氧化酶活性，進而減少穎花中過氧化氫和丙二醛的積累。高溫下SDWG005穎花中淀粉含量更高，酸性轉化酶、蔗糖合酶及ATPase基因的表達量顯著增加。【結論】減數分裂期高溫促進穎花中苯丙烷類代謝關鍵酶活性的上升和代謝產物含量的增加，耐熱品種高溫下能夠積累較多的木質素和類黃酮，具有較高抗氧化酶活性，同時蔗糖代謝和能量產生效率較高，從而具有較強的耐熱性。

水稻；高溫；穎花；苯丙烷類代謝；木質素；總黃酮

水稻是主要糧食作物之一，世界一半人口以稻米為主食。高溫是影響我國水稻產量潛力發揮與品質穩定性的最主要生態因子之一[1]。據IPCC第六次評估報告，預計21世紀全球氣溫上升將達到或超過1.5℃，氣候變暖將導致水稻生長季溫度升高[2,3]。研究表明，抽穗期和開花期是高溫脅迫導致結實率降低的敏感時期[4]，開花當天的溫度高于35℃，持續時間超過2 h就會引起穎花育性下降，嚴重影響結實率；水稻生殖期最低溫度每上升1℃，水稻產量將下降10%[5, 6]。而水稻花粉母細胞減數分裂期遭遇持續高溫會使花藥內壁絨氈層提前降解，花粉活力降低，同時會降低花粉的附著率和萌發率，嚴重影響水稻的結實率[7,8]。因此，解析水稻高溫花器官育性傷害機理及其調控機制，對水稻熱害防御、耐熱栽培及品種改良具有重要意義。

花器官受高溫脅迫傷害程度最大，高溫嚴重影響水稻產量的形成[9,10]。高溫脅迫既能影響絨氈層正常的細胞結構和生理，阻礙花藥成熟和開裂，又能阻礙花粉在柱頭上萌發、花粉管伸長，從而影響受精過程[11-17]。高溫可降低抗氧化酶活性，影響活性氧(ROS)穩態，引起氧化脅迫并干擾小孢子時期活性氧介導的細胞程序性死亡過程[18-20]。高溫脅迫能夠引起糖代謝和能量利用紊亂，Parish等[21]還指出，糖積累不足導致花粉育性顯著降低，淀粉的正常積累是決定花粉育性的重要指標。蔗糖合酶和蔗糖轉化酶是植物體內蔗糖分解途徑中的兩個關鍵酶，高溫脅迫下蔗糖轉化酶活性顯著降低，蔗糖降解途徑受阻，可能是導致花粉中淀粉積累量下降的主要原因[22, 23]。

莽草酸途徑是連接初級代謝和次級代謝的主要橋梁，其起始物是磷酸戊糖途徑的中間產物4-磷酸赤蘚糖和糖酵解的中間產物磷酸烯醇式丙酮酸。而莽草酸的終產物分支酸可以進入苯丙烷代謝途徑形成木質素、類黃酮等芳香族化合物，因此苯丙烷代謝與糖代謝密切相關[24]。一些研究表明，木質素生物合成的碳源是由D-葡萄糖提供的[25]，外源可代謝糖類能夠促進擬南芥和梨愈傷組織的木質素積累[26,27]。比如，柳枝稷中過量表達蔗糖合酶PvSUS1，木質素含量會升高[28]，但在逆境條件下，糖代謝和苯丙烷代謝之間的關系報道較少。

苯丙烷類代謝是植物最重要的次生代謝途徑之一，起始反應由苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶催化，進而產生木質素和類黃酮兩類最主要的分支代謝產物[29]。黃酮類化合物作為重要抗氧化物質，在植物非生物脅迫響應中起著重要作用。研究表明，黃酮醇可通過調節高溫脅迫下ROS穩態來控制番茄花粉管的生長和完整性[23]。木質素是花藥壁的重要組成成分，參與抵抗非生物脅迫，上調木質素生物合成基因的表達會導致木質素沉積，次生細胞壁增厚，增強植物抗逆性[29-31]，參與木質素單體氧化聚合為木質素的主要為第Ⅲ類PODs，且分為可溶性及結合態。其中NADH-POD以NADH為底物產生過氧化氫，而G-POD以愈創木酚為底物，通過消耗過氧化氫來催化細胞壁中木質素的合成[32]。Dong等[33]發現水稻UDP-葡萄糖基轉移酶GSA1通過調控苯丙烷類代謝途徑，促進黃酮類物質積累，增強水稻耐熱性。目前，高溫脅迫對水稻花器官次生代謝的影響相關研究報道較少。高溫脅迫如何影響水稻穎花中苯丙烷類代謝通路以及代謝產物木質素和類黃酮的形成，這兩種代謝產物如何參與調控水稻耐熱性的生理基礎也不清楚。為此，本研究以前期篩選的8份耐熱性差異水稻品種為材料，研究高溫對苯丙烷類代謝關鍵酶、代謝產物以及其與育性指標之間的關系，并進一步選擇極端耐高溫的SDWG005和極端不耐高溫的綿恢101來分析高溫通過苯丙烷類代謝調控耐熱性的生理機制，以期為豐富水稻耐熱機理和品種選育提供理論基礎及技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年和2022年在長江大學農學院試驗基地進行，供試材料選用廣陸矮15(常規秈稻)、綿恢101(常規秈稻，對高溫極端敏感)、SDWG005(非洲常規稻，極端耐高溫)、N22(非洲稻)、全兩優681(雜交秈稻)、Y兩優900(雜交秈稻)、Y兩優1號(雜交秈稻)和兩優培九(雜交秈稻)。盆栽實驗用桶為內徑30 cm、高32 cm的塑料桶。供試土壤為0－20 cm的稻田表層土，經風干后過4 mm篩，12.5 kg/桶，均勻拌入10 g復合肥(N∶P2O5∶K2O=26∶10∶15)。采用積溫法調整播種日期以使各水稻品種的抽穗開花期基本一致，于大田播種育秧20 d后選取生長一致且健壯的幼苗移栽，移栽時植株沿桶壁栽培成圓形，距桶邊緣大約2 cm，每桶20株，每個品種每處理設置20盆，在水稻生長過程中定期剪除分蘗，只留主莖。

1.2 處理設置

利用日光型人工氣候室(型號 AGC-MR，浙江求是人工環境有限公司)模擬大田晝夜溫度變化，設置常溫(CK)和高溫(HT)兩個溫度水平，濕度為恒濕模式(75%)，溫度的具體變化過程見圖 1。CK和HT的日最高氣溫和日平均氣溫分別為26℃和23.5℃、38℃和33.5℃。于各水稻減數分裂期分別移入人工氣候室中進行不同溫度處理。為保證所取水稻的生長發育進程和處理條件一致，于CK和HT處理的當天對發育進程基本一致的稻穗(葉枕距約為2 cm)進行掛牌標記，處理5 d后將水稻植株均放置在適溫條件下繼續生長直到成熟。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 水稻花粉活力和穎花受精率統計

在水稻開花期，剝取未開放穎花的花藥，進行1% KI/I2染色，隨后于光學顯微鏡觀察并拍照，統計花粉活力。花粉活力(%)=染色花粉數×100/總花粉粒數。在水稻成熟期考查穎花受精率，凡有結實觸感的飽粒和癟粒均計為受精粒，其余計為非受精粒，穎花受精率(%)=受精粒數×100/總粒數。

1.3.2 苯丙烷類代謝途徑中關鍵酶活性測定

待HT處理結束后，剝取掛牌標記稻株的幼穗，每個品種每種處理取樣15穗，3次重復。用液氮冷凍處理并移至?80℃冰柜中備用。參照Liu等[34]的方法測定苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia -lyase, PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate：coenzyme A ligase, 4CL)的活性。取冷凍小穗(0.1 g)并研磨成粉末，使用PAL提取液[50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.8)，2%(/)聚乙烯吡咯烷酮，5 mmol/L β-巰基乙醇]、C4H提取液[50 mmol/L Tris-HCl，4 mmol/L MgCl2，15 mmol/L β-巰基乙醇，10 μmol/L 亮抑蛋白酶肽，5 mmol/L L-抗壞血酸，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.1%(/)PVPP和10%(/)甘油]、4CL提取液[0.2 mol/L Tris-HCl(PH 7.5)，25%甘油，0.1 mol/L 二硫蘇糖醇]進行處理。將適量提取液加入分裝樣品中，在4℃的搖床中以250 r/min提取1 h，然后在離心機中12 000下離心30 min，取上清酶液。

PAL活性測定：取250 μL 粗酶提取物，加入250 μL含有0.02 mol/L 苯丙氨酸的50 mmol/L硼酸緩沖液(pH 8.8)，用50 mmol/L硼酸緩沖液(pH 8.8)補足至1 mL，對照組使用滅活酶溶液，將混合物在37℃下孵育1 h，加入50 μL 6 mol/L 鹽酸停止反應。測定PAL在290 nm處的吸光度。

C4H活性測定：將200 μL 酶提取物加入2 mL 反應液(8 μmol/L 反式肉桂酸，3 μmol/L NADPNa2，6 μmol/L G-6-PNa2，50 mmol/L Tris-HCl)，在25℃下孵育30 min，加入100 μL 6 mol/L 鹽酸停止反應，在340 nm處測定吸光值。

4CL活性測定：將0.5 mL 粗酶提取物加入到0.45 mL 75 mmol/L MgCl2，0.15 mL 1 μmol/L 輔酶A，0.15 mL 0.8 mmol/L ATP和0.15 mL 2 mmol/L對香豆酸混合的反應溶液中，并在333 nm處測量4CL的活性。

圖1 常溫與高溫人工氣候室的溫度設置

表1 基因表達分析使用的引物

1.3.4 木質素、總黃酮和總酚含量測定

參照張水明等[35]的方法采用巰基乙酸法測定木質素含量。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[36]，以蘆丁標準品繪制標準曲線，測定總黃酮含量。利用福林-酚法，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，測定總酚含量。

1.3.5 抗氧化物酶活性、過氧化氫、丙二醛和ATP含量測定

過氧化物酶和超氧化物歧化酶的酶活性測定參照王成章等的方法[37]。抗壞血酸氧化酶的活性測定參照NaKano等的方法[38]。丙二醛含量使用索萊寶丙二醛含量檢測試劑盒(BC0020)測定。過氧化氫含量測定使用索萊寶的過氧化氫含量檢測試劑盒(BC3590)。ATP含量使用索萊寶ATP含量檢測試劑盒(BC0305)測定。

1.3.6 碳水化合物含量測定和蔗糖代謝基因表達水平分析

參照李光彥[39]的方法，分別取0.5 g 綿恢101和SDWG005冷凍小穗粉末，測定可溶性糖、可溶性淀粉和非結構性碳水化合物的含量。稱取1 g 綿恢101和SDWG005的冷凍小穗粉末，Trizol法提取總RNA，并反轉錄為cDNA。以水稻為內參進行qRT-PCR，反應體系包括cDNA模板1 μL(約80 ng)、上游引物及下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、10 μL熒光定量反應液(2 × Universal SYBR Green FAST PCR Mix)。采用2法對基因表達數據進行分析處理，使用引物如表1所示。

1.3.7 細胞壁氧化酶活性測定

細胞壁游離態和結合態愈創木酚過氧化物酶的活性測定參照劉清泉[40]的方法進行，略有修改。取0.1 g冷凍小穗粉末，加入2 mL蛋白質提取液(25 mmol/L MOPS，pH 7.0，200 mmol/L CaCl2)研磨，12000×下低溫離心15 min，上清液為粗蛋白提取液，用于測定細胞壁游離態愈創木酚過氧化物酶。離心得到的沉淀用蛋白質提取液洗滌3次，棄上清液，加入10倍沉淀體積的含1%纖維素酶、0.1%果膠酶的0.1 mol/L乙酸緩沖液(pH 5.6)水解過夜，12000×下低溫離心取上清液，用于測定細胞壁結合態愈創木酚過氧化物酶的酶活性。漆酶的活性測定使用索萊寶的漆酶活性檢測試劑盒(BC1630)進行。

1.3.8 間苯三酚染色

取CK和HT處理5 d水稻幼穗中部的穎殼進行木質素間苯三酚染色，按照上海源葉木質素間苯三酚染色液(R30443)使用說明進行。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010整理數據，SAS 9.2統計分析數據，Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結果與分析

2.1 減數分裂期高溫脅迫對水稻花粉活力和穎花受精率的影響

圖2-A顯示，HT顯著降低了8個水稻品種的花粉活力，其中降幅最小的品種為N22，降幅3.9個百分點；其次是全兩優681，降幅為5.0個百分點；綿恢101降幅最大，高達39.4個百分點。圖2-B顯示，除N22以外，HT顯著降低了其余7個水稻品種的穎花受精率，其中，廣陸矮15、SDWG005、N22和全兩優681的穎花受精率降幅小于其他品種，分別為25.6、17.7、8.8和23.1個百分點，綿恢101、兩優培九、Y兩優900和Y兩優1號的穎花受精率降幅均超過30個百分點，其中綿恢101降幅最大，高達60.7個百分點。結合穎花受精率和花粉活力數據比較基因型間的差異，可以認定N22、廣陸矮15、sDWG005和全兩優681為耐熱品種，兩優培九、Y兩優900、Y兩優1號和綿恢101是熱敏感品種。

2.2 減數分裂期高溫脅迫對穎花中苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶活性的影響

圖3-A顯示，在CK處理下，N22的苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性最高，其次是廣陸矮15；高溫處理后，N22和全兩優681的PAL活性顯著降低，SDWG005的PAL酶活性大幅度增加，相比于CK處理增加了45.48%。敏感品種的PAL酶活性在高溫前后無變化或變化幅度較小。由圖3-B和3-C可知，在HT處理下，肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)活性在不同水稻品種間均有不同幅度上升，耐性品種的C4H和4CL酶活性增幅總體上高于敏感品種，其中敏感品種綿恢101的C4H和4CL酶活性在CK和HT下均顯著低于耐性品種。以上說明，減數分裂期高溫脅迫主要影響肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶的活性，且耐性品種和敏感品種間存在顯著差異。

GLA15－廣陸矮15；QLY681－全兩優681；LYP9－兩優培九；YLY900－Y兩優900；YLY1－Y兩優1號；MH101－綿恢101。平均值±標準差，n = 3，柱狀圖上不同小寫字母表示不同品種及處理間差異達5%顯著水平。下同。

圖3 不同水稻品種減數分裂期高溫處理下苯丙烷類代謝途徑關鍵酶活性比較

2.3 減數分裂期高溫脅迫對穎花木質素、總黃酮和總酚含量的影響

如圖4-A所示，高溫處理下8個水稻品種的木質素含量均顯著增加，相比CK增加了約0.4～2.5倍，其中耐性品種增幅總體大于敏感性品種。總黃酮含量也受到高溫脅迫的影響，除N22增幅不明顯外，其他品種均有不同幅度的增加，綿恢101增加了24.8%，廣陸矮15、SDWG005和全兩優681分別增加了33.8%、42.1%和41.9%，HT下耐性品種總黃酮含量增幅總體顯著高于敏感品種(圖4-B)。圖4-C顯示，除N22外，高溫處理下其余7個水稻品種穎花中總酚含量均有增加，廣陸矮15增幅最大，高達69.4%。以上說明減數分裂期高溫促進了穎花中苯丙烷類代謝通路中三類主要代謝產物積累，特別是木質素和總黃酮含量，二者在耐性品種和敏感性品種間增幅差異顯著。

圖4 不同水稻品種減數分裂期高溫處理下穎花木質素、總黃酮和總酚含量的比較

表2 CK和HT處理下苯丙烷類代謝及下游分支代謝途徑相關指標相關性分析

為進一步明確哪一種代謝產物與高溫結實傷害關聯最顯著，我們將花粉活力、穎花受精率、苯丙氨酸解氨酶活性、肉桂酸-4-羥化酶活性、4-香豆酸輔酶A連接酶活性、總酚含量、總黃酮含量、木質素含量等指標進行相關性分析。分析結果顯示CK處理下苯丙氨酸解氨酶活性和4-香豆酸輔酶A連接酶活性與總酚、總黃酮和木質素等三種代謝產物含量均極顯著相關，肉桂酸-4-羥化酶活性與總酚含量也極顯著相關，但是花粉活力和穎花受精率均與關鍵酶活性(苯丙氨酸解氨酶活性、肉桂酸-4-羥化酶活性和4-香豆酸輔酶A連接酶活性)和代謝產物(總酚、總黃酮和木質素)含量相關不顯著(表2)。但是，高溫處理下，花粉活力與肉桂酸-4-羥化酶活性、木質素含量極顯著相關，穎花受精率與木質素含量也極顯著相關，木質素含量與總黃酮含量極顯著相關(表2)。由此可見，高溫引起穎花中木質素和總黃酮含量積累，且敏感性品種中積累水平較低，可能是影響高溫下水稻結實的一個重要因素。

2.4 減數分裂期高溫脅迫對穎花細胞壁過氧化物酶活性的影響

以高溫下苯丙烷類代謝通路具有顯著差異的水稻品種SDWG005和綿恢101為材料，進一步分析減數分裂期高溫如何影響木質素積累。如圖5所示，間苯三酚染色顯示高溫處理促進了水稻小穗穎殼木質素積累，且SDWG005木質化水平高于綿恢101。木質素氧化聚合依靠相關細胞壁氧化物酶作用，高溫顯著增加了以H2O2為底物的愈木創酚過氧化物酶活性，SDWG005增幅大于綿恢101。穎花中以NADH為底物的NADH過氧化物酶活性在高溫下也受到激活，SDWG005中激活的是可溶態NADH過氧化物酶，綿恢101中激活的是細胞壁結合態NADH過氧化物酶。漆酶活性同樣受到高溫的影響，不同的是SDWG005穎花漆酶活性在高溫下無顯著變化，而綿恢101漆酶活性則受到顯著抑制(圖5)。以上說明高溫下穎花中不同形態的過氧化物酶活性呈上升趨勢，且酶活性總體水平SDWG005高于綿恢101，因此，SDWG005木質素積累水平較高。

柱狀圖上不同小寫字母表示不同品種及處理間差異達5%顯著水平。

2.5 減數分裂期高溫脅迫對水稻穎花抗氧化系統、碳水化合物代謝和能量產生的影響

如圖6所示，高溫顯著增加了SDWG005穗部過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。對綿恢101來說，穗部過氧化物酶對減數分裂期高溫脅迫相對鈍感，超氧化物歧化酶活性甚至出現顯著降低。此外，SDWG005和綿恢101穗部抗壞血酸過氧化物酶活性呈現下降趨勢，其中綿恢101降幅較大。因此，高溫脅迫下綿恢101穗部相比SDWG005積累了較多的過氧化氫和丙二醛含量(圖6)。

進一步測定耐性品種和敏感性品種高溫處理下穗部碳水化合物含量。如圖6所示，高溫促進了可溶性糖、可溶性淀粉和非結構性碳水化合物等的積累，可溶性糖含量綿恢101增幅大于SDWG005，但是可溶性淀粉和非結構性碳水化合物綿恢101增幅均小于SDWG005。通過熒光定量PCR分析穎花蔗糖代謝關鍵基因和表達水平，結果顯示SDWG005穎花中的基因表達在高溫下受到誘導上調表達，而綿恢101穎花中的基因表達在高溫下受到明顯抑制。此外，饑餓響應基因和受高溫誘導上調表達，表達并不受高溫的影響，且的表達在SDWG005中上調幅度顯著大于綿恢101，SDWG005 的ATP含量在高溫下顯著增加，而綿恢101增加不顯著。以上說明減數分裂期高溫影響了敏感性品種綿恢101穎花淀粉積累水平和能量水平，這可能是高溫引起敏感性品種產生結實傷害的原因之一。

3 討論

不同的水稻品種產量是由其作物遺傳特性決定的[41]。而高溫作為一種非生物脅迫，能夠極大地影響水稻正常的生長發育，并影響其產量。其中，水稻在生殖生長階段對高溫脅迫較為敏感，特別是減數分裂期花粉形成過程中高溫通過影響花粉發育過程中的物質和能量代謝，引起花粉敗育，進而影響授粉受精過程，導致結實率下降，但品種間耐熱性存在顯著差異[42,43]。本研究發現不同的水稻品種在高溫脅迫下表現出花粉活力和穎花受精率的變化，其中N22、廣陸矮15、SDWG005對高溫的耐受性較高，而綿恢101對溫度極為敏感。目前對于不同品種水稻的耐熱機制研究較少。前人研究表明，外施水楊酸(SA)能顯著增加水稻的耐熱性，減緩花藥抗氧化酶活性的下降，減少花藥中ROS及MDA含量的上升，從而減少花藥絨氈層細胞程序性死亡(PCD)的產生，減輕高溫下花粉粒敗育[44]。SA合成關鍵酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)共同引導上游產物進入苯丙烷類代謝途徑下游分支[45]，其中木質素和類黃酮分別為兩個分支的代謝產物，在非生物脅迫中其著重要作用[29,46]。目前對苯丙烷代謝響應非生物脅迫的研究較多，木質素和類黃酮含量的變化會引起花粉育性的改變[29]。本研究發現，水稻中苯丙烷代謝產物在高溫脅迫后加速積累，耐高溫材料的苯丙烷代謝產物的含量在高溫處理下相比于敏感材料高出不少，并且不同水稻品種的苯丙烷代謝產物積累量與水稻的育性指標呈正相關。進一步分析表明，苯丙烷代謝上游途徑中的肉桂酸-4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A連接酶受到高溫的顯著誘導，說明了上游關鍵酶的活性是苯丙烷代謝產物積累的關鍵原因，然而作為水楊酸合成關鍵酶的苯丙氨酸解氨酶的活性在高溫下并沒有顯著變化，推測這可能是由于在植物中水楊酸合成途徑主要是異分支酸合成酶途徑(ICS)，而非苯丙氨酸解氨酶途徑(PAL)[47]，同時有研究表明酚類物質的合成一般不受PAL活性的控制，這與我們的實驗結果一致[48]。木質素是花藥細胞壁的組成成分之一，由木質素單體在細胞壁氧化酶和漆酶的催化下聚合而成[32]。本研究發現敏感材料的漆酶活性受到了抑制，而抗性材料的漆酶活性無顯著變化，但細胞壁過氧化物酶活性顯著提升，這有利于木質素的合成以維持花藥細胞壁的形成。同時，在形成木質素的過程中，細胞壁過氧化物酶也會消耗更多的過氧化氫，有利于水稻在高溫下的生長。有研究指出，黃酮類化合物是一類重要的抗氧化物質，可以激活抗氧化酶活性以及清除過量的ROS，維持正常的花粉育性及花粉管的生長[30]。本研究發現耐性品種在高溫處理下具有更高的抗氧化酶活性，較少的H2O2和MDA含量。說明耐熱品種在積累更多的木質素和類黃酮的過程中，水稻花粉ROS穩態受到影響，維持了較高的花粉育性。

可溶性糖作為一種滲透調節物質，對細胞具有滲透調節及保護細胞膜結構穩定的作用。苯丙烷類代謝初產物苯丙氨酸由糖代謝中的莽草酸途徑產生，苯丙烷類代謝途徑與糖代謝聯系緊密。有研究指出，糖代謝能夠為苯丙烷類代謝提供碳骨架，間接參與苯丙烷類代謝途徑[24]。本研究觀察到，高溫顯著增加穎花中可溶性糖、可溶性淀粉和非結構性碳水化合物的含量，說明糖類有助于水稻在熱應激下正常生長，但是敏感材料綿恢101的可溶性糖增幅大于抗性材料SDWG005。一方面可能是由于熱應激下為苯丙烷類代謝途徑提供底物消耗，另一方面由于蔗糖轉化酶()基因受高溫誘導上調表達。前人研究表明，蔗糖合酶和轉化酶受到抑制會導致植物的育性指標下降[49]，這與我們發現SDWG005中這兩種酶基因表達量較高，花粉活力比綿恢101高具有一致性。研究表明，SnRK1和TOR蛋白激酶作為能量管理的樞紐，逆境條件下營養物質不足或能量缺乏時SnRK1被激活抑制植株生長以減少消耗能量的合成代謝，而TOR在能量充足時刺激生物合成代謝[50,51]。能量代謝是植物體現對逆境環境耐受性的一方面，能量不足會導致植物抗逆性下降[52]。高溫處理下和基因表達量增加，基因表達量無顯著變化，說明高溫導致穎花中碳水化合物代謝受阻，能量處于缺乏狀態。SDWG005中基因表達量顯著增加，而綿恢101中基因表達量增幅較小，也說明在高溫熱害下耐性品種仍具有較高的能量水平，能夠為提高抗氧化能力提供充足的能量，最終增強水稻耐熱性。

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Effects of High Temperature on Phenylpropane Metabolism and Downstream Branch Metabolic Pathways in Rice Meiosis

WANG Shengyong1, CHEN Yuhang1, CHEN Huili1, HUANG Yujie1, ZHANG Xiaotian1, DING Shuangcheng2,*, WANG Hongwei1,*

[MARA Key Laboratory of Sustainable Crop Production in the Middle Reaches of the Yangtze River (Co-construction by Ministry and Province)/College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; Engineering Research Center of Ecology and Agricultural Use of Wetland, Ministry of Education/ College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; Corresponding author, email: shchding@yangtzeu.edu.cn; wanghw@yangtzeu.edu.cn]

【Objective】Our purposes are to investigate how high temperature during rice meiosis affects phenylpropane metabolism and analyze its relationship with heat tolerance of rice. 【Methods】Eight rice varieties differed in heat tolerance including N22, GLA15 (Guanglu’ai 15), SDWG005, QLY681 (Quanliangyou 681), YLY900 (Y Liangyou 900), YLY1 (Y Liangyou 1), LYP9 (Liangyoupeijiu), and MH101 (Mianhui 101) were used as experimental materialsand exposed to room temperature and high temperature for 5 days. The correlations between activities of key enzymes in phenylpropane metabolism and main metabolite contents such as lignin, total flavonoids and total phenols were analyzed as well as the fertility of rice under high temperature stress during the meiotic stage. SDWG005 (heat resistant) and MH101 (heat sensitive) were used as experimental materials to analyze the effects of phenylpropane metabolism, carbohydrate metabolism and antioxidant defense system on heat tolerance of rice. 【Results】1) Compared with the control, the pollen vitality and fertilization rate of spikelets decreased significantly to various extents at high temperature. 2) HT(high temperature) significantly increased the activities of cinnamate-4-hydroxylase and 4-coumaric acid coenzyme A ligase, as well as the accumulation of lignin, flavonoids and total phenols in spikelets, with resistant varieties registering a higher growth than sensitive ones. 3) Correlation analysis showed that in response to HT pollen activity was significantly correlated with cinnamate-4-hydroxylase activity and lignin content, spikelet fertility was significantly correlated with lignin content, and lignin content was significantly correlated with flavonoid content. 4) Compared with MH101, lignin accumulation in the glumes of SDWG005 was significantly induced under HT. And higher cell wall peroxidase activities were maintained in SDWG005 under HT. 5) Compared with MH101, SDWG005 could maintain higher antioxidant enzyme activities under HT, resulting in less accumulation of H2O2and malondialdehyde. Under HT, the starch level in SDWG005 flowers was higher, and the expression levels of genes involved in acid invertase, sucrose synthase and ATPasewere significantly upregulated. 【Conclusion】High temperature stress increases the key enzyme activities and metabolite contents in the phenylpropanoid pathway in spikelets during the meiosis stage. The resistant variety accumulates more lignin and flavonoids during HT, has higher antioxidant enzyme activities, higher sucrose metabolism and energy utilization efficiency, thereby improving heat tolerance.

rice; high temperature; spikelet; phenylpropane metabolism; lignin; flavonoids

10.16819/j.1001-7216.2023.221112

2022-11-24；

2023-02-07。

濕地生態與農業利用教育部工程研究中心開放基金資助項目（KFT202012）；主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心開放基金資助項目（KFT202108）。