EMS誘變對不同萌發狀態草莓種子發芽率的影響

宋蘭芳, 華明艷, 崔少杰, 金鳳媚, 孔維東, 孫海波

(天津市農業科學院 現代都市農業研究所, 天津 301700)

0 引言

【研究意義】育種中常用的化學誘變劑主要有烷化劑(如甲基磺酸乙酯、甲基硫酸甲酯)堿基類似物、疊氮化鈉及抗生素[1]。甲基磺酸乙酯(EMS)誘變譜非常廣,能產生斷裂突變、錯義突變等[2],而且EMS在多倍體植物中產生的點突變頻率很高[3],是一個高效的誘變劑,對植株損傷較小,產生的突變性狀豐富,而且多為顯性突變體,便于突變體的篩選,可以針對植物某一性狀進行有效改良。草莓的高雜合性和多倍性等特點,導致其新品種培育存在培育周期長、效率低、工作量大等問題[4],因而需要研究效率更高的育種手段,為草莓新品種的選育提供豐富的種質資源和遺傳背景。【前人研究進展】EMS已在水稻[5]、小麥[6]、玉米[7]等多種作物中用于新種質的創造及突變體庫的構建[8-9],目前我國關于EMS在草莓上的誘變研究相對較少。草莓誘變育種是獲得新種質資源和選育新品種的有效途徑之一,其與雜交育種和生物技術結合,更能提高育種效率和水平[10]。劉艷萌等[11]以草莓繼代苗為材料,經過EMS處理后培養誘導出再生植株,然后以0.8% NaCl為選擇壓力進行初步篩選后,發現再生植株對鹽漬環境表現出一定的抗性。羅靜等[12]使用EMS對草莓品種“幸香”葉片誘導出愈傷組織進行處理后,將愈傷組織接種在含有不同濃度灰霉病毒粗提液的培養基上,發現其對灰霉病抗性突變發生不表現規律性。張經緯[13]采用濃度為0.8%EMS處理草莓品種“豐香”種子48 h,篩選得到一批表型發生顯著變化的單株,變異率約為1%,變異大多發生于葉片和果實。【研究切入點】EMS誘變在草莓中的研究材料主要是不同部位的離體材料或愈傷組織,以草莓種子為試材的EMS誘變報道較少。【擬解決的關鍵問題】通過研究EMS誘變對草莓不同種子萌發率的影響,旨在觀察EMS對草莓種子的誘變反應,確定EMS對草莓種子誘變的最佳條件,為后期八倍體草莓突變體庫的構建奠定基礎,為進一步發展草莓的EMS誘變育種提供科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為天津市農業科學院選育的八倍體草莓品種“津韻1號”自然授粉種子。

1.2 試驗設計

試驗在天津市農業科學院創新基地進行。以4種不同萌發狀態的草莓種子即風干種子(自然晾干種子)、吸脹種子(種子浸泡36 h)、萌動種子(種皮吸脹微開裂未露芽種子)和萌發種子(冒白尖的種子)為試驗材料,設置5個EMS濃度處理梯度(0%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%),每個濃度設置3個處理時間(8 h、12 h、16 h),共60個處理,其中以0% EMS為對照(CK),每處理100粒種子,3次重復。

挑選不同萌發狀態的種子,用紗布包好,放入裝有不同濃度EMS的藍蓋試劑瓶中進行誘變處理,期間置于溫度25 ℃、轉速80 r/min的搖床上,分別處理8 h、12 h、16 h后,將種子取出,用流水沖洗12 h,以去除種子表面殘留試劑。將誘變處理后的種子置于鋪有濾紙的培養皿中進行發芽,隨后置于恒溫培養箱中25 ℃培養,培養1周后進行指標調查。

1.3 調查指標與方法

以CK為參照,在培養過程中,每天進行補水,同時觀察種子發芽情況,準確記錄種子的起始發芽時間和每日種子發芽數,在培養20 d后,統計種子最終發芽數,并計算草莓種子的發芽率,確定半致死劑量。

發芽率=種子發芽數/種子總數×100%

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2000對測定數據進行統計,用SPSS19.0以Ducan新復極差法進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 EMS處理草莓風干種子的發芽率

由表1可知,在相同時間下,CK草莓風干種子的發芽率均最高,除處理8 h的CK與EMS濃度為0.4%處理間差異不顯著外,均顯著高于其他處理。風干種子的發芽率隨EMS處理濃度升高而下降,說明EMS對風干草莓種子的萌發有抑制作用。在相同濃度下,EMS濃度為0%～0.4%時,風干種子的發芽率隨處理時間延長而升高;EMS濃度為0.6%～1.0%時,風干種子的發芽率隨處理時間延長先升高后降低。說明,在低濃度時EMS誘變時間抑制效應在一定程度上大于誘變濃度,可能因為風干種子種皮吸水性較差,對水分和藥劑吸收較少,因此進行誘變試驗不建議選用風干種子進行處理。

表1 EMS不同濃度和處理時間草莓風干種子的發芽率

2.2 EMS處理草莓吸脹種子的發芽率

由表2可知,草莓吸脹種子的發芽率均高于風干種子,說明草莓種子吸足水分有助于萌發。在相同時間下,吸脹種子的發芽率隨EMS處理濃度升高而降低,這與風干種子一致。在相同濃度下,EMS濃度為0～0.4%時,吸脹種子發芽率隨處理時間延長先升高后降低;EMS濃度為0.6%～1.0%時,吸脹種子的發芽率隨處理時間延長而下降。CK吸脹種子在12 h發芽率最高,16 h次之,8 h最低,說明草莓種子萌發吸足水分所需時間在44～52 h;吸脹種子處理之前種子內部代謝已經活化,誘變劑吸收相對更容易,所以EMS相同濃度下,16 h的發芽率低于12 h。

2.3 EMS處理草莓萌動種子的發芽率

由表3可知,在相同時間下,隨著EMS處理濃度增加,草莓萌動種子的發芽率總體呈顯著下降趨勢,以處理16 h的發芽率下降幅度最大。在相同濃度下,草莓萌動種子的發芽率均隨處理時間增加而下降;EMS濃度在0～0.6%時,處理8 h與處理12 h間的萌動種子發芽率差異不大,但均明顯高于處理16 h,說明草莓種子在吸足水分后,不能長時間浸泡;EMS濃度在0.8%～1.0%時,草莓萌動種子的發芽率隨處理時間延長顯著下降,其中,EMS濃度為0.8%處理12 h時,草莓種子的發芽率為52.00%。EMS濃度為0.8%處理12 h時和EMS濃度為0.6%處理16 h時的致死率均接近半致死劑量,可作為EMS誘變條件之一,因為萌動種子長時間浸泡會抑制發芽,所以推薦EMS濃度為0.8%,處理12 h作為萌動種子的最佳誘變條件。綜上表明,低濃度EMS處理對草莓種子的發芽率毒害作用較小,隨作用時間延長毒害作用顯著;高濃度EMS處理對草莓萌動種子的發芽率毒害作用較大,即使時間較短,發芽率也顯著降低。

2.4 EMS處理草莓萌發種子的發芽率

由表4可知,在相同時間下,隨著EMS處理濃度升高,草莓萌發種子的發芽率急劇下降,高濃度EMS處理的發芽率顯著低于低濃度和CK,說明EMS對草莓萌發種子的毒害作用顯著,可能是因為萌發種子的幼芽更容易吸收藥劑,受到的毒害作用更強。在相同濃度下,隨著處理時間延長,草莓萌發種子的發芽率下降,在EMS濃度為1.0%、處理時間為16 h時,草莓萌發種子全部致死;在EMS濃度為0.4%和0.6%、處理時間為16 h時,種子的發芽率分別為56.33%和45.33%,接近半致死劑量,可用作EMS誘變條件之一,但鑒于萌發狀態的種子嫩芽移栽時容易人為損傷,不推薦大批量應用。

表4 EMS不同濃度和處理時間草莓萌發種子的發芽率

3 討論

種子作為植物最基本的生殖器官,可以在誘變前后較長時間保存自身活性以及誘變所致的變異基因,而且試驗在常規環境下即可進行操作,誘變程序簡單易行,雖然存在滯后性,誘變的性狀差異需要在M2、M3代得以表達,但是所能表現出來的差異性狀往往可以遺傳,從而可以免去后期相關鑒定程序[14]。研究表明,不同狀態的草莓種子對EMS的敏感度不同,分析可能原因:一是EMS與水溶液混合后會產生有毒物質。EMS的生產方法一般是通過甲磺酸和乙醇反應,甲磺酸能引起植物明顯損傷和不育,有毒物質對不同萌發狀態種子種皮的滲透能力不同,因而導致不同狀態種子的發芽率不同。二是成熟種子的胚細胞被許多有活力的細胞包圍,再加上細胞膜的選擇透過性會阻礙EMS進入胚細胞[15-16]。因此,EMS相同濃度處理時間不同,發芽率不同,尤其是高濃度處理中,隨時間延長,有毒物質對膜的損傷加劇,導致發芽率下降。

在化學誘變育種中想要獲得有效的誘變效果,需要確定適宜的誘變劑量,既能達到最高的變異率和較寬的變異譜,又不能過分地損傷植株,是確定植物適宜誘變劑劑量的重要指標;過高的化學誘變濃度會提高突變率,但容易導致植物死亡率升高,并會因細胞嚴重受損而造成不良突變的增加,從而掩蓋其他的突變,不利于有利突變性狀的產生,影響化學誘變效果[17]。本研究中,EMS誘變對草莓種子的發芽率在不同處理時間和濃度以及不同種子萌發狀態上均存在差異,表明草莓種子對EMS處理存在敏感性,各處理組合不是單因素簡單相加,只有在合適的濃度和時間組合下才能得到適宜的處理條件[18]。研究表明,草莓萌動種子在EMS濃度0.8%、處理時間12 h時萌發率下降至50%左右,達到半致死劑量,可作為試驗篩選的誘變條件。與胡志峰等[19]對金花菜種子上的研究,即EMS誘變濃度抑制效應在一定程度上大于誘變時間的結論一致。本試驗僅研究了EMS對八倍體“津韻1號”草莓種子萌發率的影響,以半致死劑量為參考,確定EMS誘變草莓種子的最佳條件,試驗中所獲得的植株是否在分子層面發生了變異還有待考證。

4 結論

不同吸水程度和萌發狀態的草莓種子對EMS的敏感度不同,在處理中應根據種子大小、種皮厚度、種子發芽勢等指標確定最適合種子誘變的萌動狀態。EMS誘變對草莓種子的發芽率在不同處理時間和濃度以及不同種子萌發狀態上均存在差異,各處理組合不是單因素簡單相加,只有在合適的濃度和時間組合下才能得到適宜的處理條件,在處理中應根據實際需要的誘變效果選擇誘變條件。本試驗條件下,萌動種子在EMS濃度為0.8%,處理時間為12 h,草莓種子的發芽率接近半致死劑量,確定為EMS誘變草莓種子的最佳條件。