高效液相色譜法測定雀辣中辣椒素及類似物的含量

白銘松，何佳艷，熊彩云，袁 潘，李成功，潘文麗

（祥云縣綜合檢驗檢測院，云南大理 671000）

雀辣資源主要分布于云南普洱地區、西雙版納地區和德宏地區。雀辣在普洱地區主要分布于寧洱縣黎明鄉、磨黑鎮把邊江流域和勐野江流域，當地人稱其為雀屎辣。顧曉振等[1]研究證實了雀辣更傾向于灌木辣椒（Capsicum frutescens）。辣椒素和二氫辣椒素是辣椒中的主要生物活性成分，已有研究證實辣椒素具有抗氧化、預防心血管疾病、保護胃腸黏膜和抗腫瘤等多種功效[2-10]，今后可從提取辣椒素及類似物的途徑發展到醫藥等領域的應用和研究。

辣椒素的含量可使用液相色譜法[11-12]、氣相色譜法[13]、液相色譜質譜聯用法[14-15]等方法進行測定，但目前鮮有雀辣中辣椒素及二氫辣椒素分析檢測的報道。本文建立和優化了雀辣中辣椒素和二氫辣椒素的含量測定方法，并對普洱雀辣和西雙版納雀辣中辣椒素及二氫辣椒素的含量進行分析比較，為雀辣產業的發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

普洱雀辣采購于云南寧洱縣黎明鄉，西雙版納雀辣購于云南西雙版納（所有樣品經烘干后備用）；辣椒素（成都曼思特生物科技有限公司，純度為98.61%）；二氫辣椒素（Stanford Chemicals，純度為99.11%）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司，GZX-GF-101）；分析天平（梅特勒，ME204T）；高效液相色譜儀（賽默飛，UItimate 3000）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

方法一：取樣品約0.5 g，分別加入10 mL、5 mL、5 mL 70%乙醇溶液超聲提取3次，每次提取20 min，合并提取液，混勻后直接過0.45 μm濾膜，待測定。方法二：稱取樣品約1 g，分別加入20 mL、15 mL、15 mL 50%乙醇溶液超聲提取3次，每次提取20 min，合并提取液，精確量取20 mL于蒸發皿中蒸至近干，加甲醇溶解并轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻后過0.22 μm濾膜，待測定。

1.2.2 標準溶液的配制

分別稱取辣椒素、二氫辣椒素0.019 45 g、0.015 89 g（精密稱定），用甲醇溶解并稀釋定容至10 mL，得到濃度為1.92 mg·mL-1的辣椒素和濃度為1.57 mg·mL-1的二氫辣椒素儲備溶液。分別準確吸取辣椒素、二氫辣椒素儲備溶液0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.05 mL和0.10 mL于10 mL容量瓶中并用甲醇定容至刻度，配成辣椒素濃度為0.019 2 mg·mL-1、0.038 4 mg·mL-1、0.076 7 mg·mL-1、0.095 9 mg·mL-1和0.191 8 mg·mL-1，二氫辣椒素濃度為0.015 7 mg·mL-1、0.031 5 mg·mL-1、0.063 0 mg·mL-1、0.0787 4 mg·mL-1和0.157 5 mg·mL-1的混合標準使用液。

1.2.3 色譜條件

Acclaim? 120 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL；流動相：甲醇+1%磷酸水（80+20），等度洗脫；檢測波長：280 nm。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的優化結果

對混合標準使用液及不同前處理方法得到的樣品提取液進行檢測分析。用辣椒素和二氫辣椒素標準物質的保留時間進行定性；使用外標多點校準法，以峰面積進行定量。辣椒素和二氫辣椒素的測定結果見表1。兩種前處理方法檢測結果無顯著差異（P＞0.05），即不同的樣品處理方法對雀辣辣椒素和二氫辣椒素含量的檢測結果沒有太大的影響。但第一種方法操作簡便，所用試劑較少，故采用方法一進行方法確認并對不同產地雀辣中二氫辣椒素和辣椒素的含量進行測定。

表1 不同提取方法的辣椒素、二氫辣椒素含量（單位：mg·g-1）

2.2 方法的確認

2.2.1 線性及相關系數

將配制的混合標準使用液上機分析，以濃度為橫坐標，目標峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。辣椒素標準曲線為Y=71.856X+0.356 4，相關系數大于0.999 9，表明辣椒素在0.019 2～0.191 8 mg·mL-1線性良好。二氫辣椒素標準曲線為Y=101.2X+0.557 6，相關系數為0.999 8，表明二氫辣椒素在0.015 7～0.157 5 mg·mL-1線性良好。

2.2.2 方法檢出限和定量限

使用同一濃度的標準溶液進儀器多次測定，選取目標峰后較為平直的一段（9～10 min）作為噪音基線，得到化合物的信噪比（S/N）。根據GB/T 27417—2017中5.4.2.2信噪比法評估檢出限（LOD），并默認信噪比與濃度呈正比，計算化合物的儀器檢出濃度（信噪比為3）和儀器定量濃度（信噪比為10），得到樣品中化合物的實際檢出限與定量限。

由表2可知，辣椒素的檢出限為5.84 mg·kg-1，定量限為19.46 mg·kg-1，二氫辣椒素檢出限為4.68 mg·kg-1，定量限為15.61 mg·kg-1。從已知的資料可知[11-12,16-17]，辣椒中辣椒素和二氫辣椒素的含量遠高于所建立方法的檢出限和定量限，因此可以推廣應用于其他品種辣椒中辣椒素及二氫辣椒素的含量測定。

表2 辣椒素和二氫辣椒素的檢出限和定量限

2.2.3 方法準確度

按照定量限、2倍定量限、10倍定量限加入對照品，按照方法一進行前處理，上機分析，扣除樣品本底值后得到回收率。辣椒中辣椒素及二氫辣椒素在低加標濃度時的回收率分別為91.23%、91.06%，在中加標濃度時的回收率分別為94.85%、93.33%，在高加標濃度時的回收率分別為101.22%、99.58%。實驗結果表明該方法準確度高，準確度滿足相關標準對回收率的要求。

2.2.4 方法精密度

稱取約0.5 g的試樣6份，按照方法一進行前處理，分別進樣測定。辣椒素測定結果為3.221 mg·g-1、3.215 mg·g-1、3.173 mg·g-1、3.177 mg·g-1、3.217 mg·g-1和3.171 mg·g-1，精密度為0.8%。二氫辣椒素測定結果為0.848 mg·g-1、0.886 mg·g-1、0.851 mg·g-1、0.854 mg·g-1、0.889 mg·g-1和0.869 mg·g-1，精密度為2.1%。該方法精密度良好，滿足相關標準對方法精密度的要求。

2.3 不同產地雀辣中辣椒素和二氫辣椒素含量

使用方法一對成熟度一致的2份西雙版納雀辣、2份普洱雀辣進行處理，上機檢測分析。根據辣椒素和二氫辣椒素的峰面積求出樣品中辣椒素、二氫辣椒素的含量，結果見表3。普洱雀辣的辣椒素及二氫辣椒素的含量均明顯高于西雙版納雀辣。有研究表明辣椒中辣椒素及二氫辣椒素的含量與辣椒的品種、成熟度、地理環境等因素有關，成善漢等[18]的研究結果表明，印度超級辣椒的辣椒素含量最高達59.86 mg·g-1；吳奕敏等[17]研究了小米辣的辣椒素含量為（0.050±0.004）～（8.966±0.306）mg·g-1，二氫辣椒素含量為（0.003±0.002）～（1.311±0.055）mg·g-1；MENICHINI等[13]研究了辣椒未成熟階段辣椒素含量為（1 071±16.7）μg·g-1，成熟階段辣椒素含量為（4 363±23.1）μg·g-1。有研究發現雀辣中還含有維生素C等營養物質，較其他品種的辣椒含量更高[16]，故雀辣具有明顯的研究開發價值。

表3 不同產地雀辣的辣椒素和二氫辣椒素含量（單位：mg·g-1）

3 結論

使用該方法測定雀辣中辣椒素及二氫辣椒素，辣椒素在0.019 2～0.191 8 mg·mL-1線性良好，相關系數大于0.999 9，二氫辣椒素在0.015 7～0.157 5 mg·mL-1線性良好，相關系數為0.999 8；方法回收率為91.06%～101.22%，RSD為0.8%～2.1%。優化后的提取方法快速、穩定、準確、節省溶劑，方法適用于測定雀辣中辣椒素和二氫辣椒素的含量。雀辣中辣椒素含量為（3.190±0.025）～（5.308±0.022）mg·g-1，二氫辣椒素含量為（0.868±0.021）～（1.082±0.018）mg·g-1，普洱雀辣中辣椒素及二氫辣椒素的含量高于西雙版納雀辣。