兩性霉素B 對假絲酵母菌與乳桿菌生物膜作用的研究

尚 翔 白會會 劉朝暉▲

1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京婦幼保健院婦科，北京 100026；

2.首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京婦幼保健院檢驗科，北京 100026

外陰陰道假絲酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是女性常見的外陰陰道炎癥之一，主要由假絲酵母菌引起，75%女性一生中至少有1 次VVC 發作，且其發病率逐年升高[1-3]。對于VVC 的治療，目前主要以口服或陰道用唑類等抗假絲酵母菌藥物為主，但隨著抗假絲酵母菌藥物的大量應用，耐藥問題隨之出現[4]。而假絲酵母菌形成的生物膜可通過物理屏障作用，使藥物滲入緩慢，并保護內層假絲酵母菌，使其對環境的耐受性增強，降低抗假絲酵母菌藥物的療效[5]。

兩性霉素B（amphotericin B，AmB）作為一種多烯類抗假絲酵母菌藥物，與唑類藥物抗假絲酵母菌機制的不同使得其對VVC 臨床分離株有較高敏感性[6]，在其他抗假絲酵母菌藥物耐藥的情況下仍有良好的抗菌能力[7]。目前認為，在VVC 的治療中除殺滅假絲酵母菌外，恢復陰道微生態正常菌群更為重要，對于VVC治療并修復陰道微生態處理中，AmB 能否抑制假絲酵母菌生物膜形成及與乳桿菌制劑同時使用還是序貫使用，臨床上經驗不足且缺乏實驗證據。本研究在體外建立假絲酵母菌及乳桿菌生物膜，并通過探究AmB 對假絲酵母菌生物膜及乳桿菌生物膜的作用，觀察是否對假絲酵母菌生物膜有影響的同時對乳桿菌生物膜無相應影響，以期為AmB 在VVC 的治療及陰道微生態修復中提供更多實驗證據。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

沙氏瓊脂培養基（Solarbio，S9710）；液體沙氏培養基（Solarbio，L8300）；MRS 瓊脂培養基（Solarbio，M8330）；MRS 肉湯（Solarbio，M8540）；結晶紫（Solarbio，C8470）；PBS 緩沖液（Solarbio，P1020）；AmB（中國食品藥品檢定研究院，130334）。

1.2 實驗菌株

首都醫科大學附屬北京婦產醫院（以下簡稱“我院”）微生態實驗室分別選取2022 年7 月至8 月就診于我院的VVC 患者及健康人群，其中4 例VVC 患者為通過陰道微生態診斷評價系統鏡下見假菌絲和/或芽生孢子，證實為VVC 患者；4 名健康人群樣本選自同期檢測中證實無陰道炎人群，所有研究對象均無混合性陰道炎。采取各自陰道分泌物培養純化后通過16SrRNA 基因序列進行比對及鑒定菌株。陰道來源假絲酵母菌：1 號、2號、3 號、4 號，均鑒定為白假絲酵母菌，同源性強；陰道來源乳桿菌：5 號、6 號、7號、8 號，均鑒定為卷曲乳桿菌，同源性強。白假絲酵母菌標準株由北京大學第一醫院皮膚科實驗室提供。本研究經醫院倫理委員會審核（2022-KY-064-01）。

1.3 儀器

比濁儀（BIOMérieux，DensiCHEK plus）；酶標分析儀（南京德鐵實驗設備有限公司，HBS-1096A）；電子顯微鏡（Hitachi，S-3400N）。

1.4 研究方法

1.4.1 生物膜形成監測 采用96 孔板培養假絲酵母菌及乳桿菌。分別于培養24、48、72 h 棄菌液，PBS 漂洗，室溫干燥后加0.2%結晶紫染色30 min，再次PBS 漂洗及室溫干燥后加95%酒精脫色5 min，將液體移到新的96 孔板內，使用酶標儀580 nm 波長檢測洗脫液的OD 值。以空白組的均值加3 倍標準差為臨界值（ODc），待檢測微孔內OD 值分別以＜1 ODc、1～2 ODc、＞2～4 ODc、＞4 ODc 代表生物膜形成能力為無、弱、中和強[8-9]。

1.4.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定 參照美國臨床實驗室標準化協會制定CLSI M27-A4 方案，采用微量肉湯稀釋法測定AmB 的MIC[10]。將假絲酵母菌及乳桿菌分別與不同濃度AmB 培養48 h，以各自培養基作為陰性對照孔，僅加入假絲酵母菌或乳桿菌而未加入AmB 孔為空白對照孔，其中AmB 終濃度分別為0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.2500 0、0.5000 0、1.000 00、2.000 00、4.000 00、8.000 00、16.000 00 μg/mL，分別以肉眼見無渾濁培養孔或較空白對照孔抑菌率為80%的最低藥物濃度作為其MIC 值，其中抑菌率（%）=（空白對照孔OD 值-實驗孔平均OD 值）/（空白對照孔平均OD 值-陰性對照孔平均OD 值）×100%。以白假絲酵母菌ATCC 64548 和ATCC 64550 為質控株進行質量控制。所有實驗均重復至少3 次。

1.4.3 最小抑制生物膜濃度（minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC）測定 建立24 h單菌種生物膜，PBS 沖洗后加入系列濃度藥物的液體培養基，使AmB 終濃度分別為0.031 25、0.06 250、0.125 00、0.2500 0、0.5000 0、1.000 00、2.000 00、4.000 00、8.000 00、16.000 00 μg/ml 作為實驗組，再次培養24 h 后以肉眼未見渾濁的最低藥物濃度即為MBIC。因肉眼未見無渾濁培養孔，故采用測定生物膜OD 值方法與陽性對照孔進行對比，即以僅培養出生物膜而AmB 濃度為0μg/ml 孔為陽性對照組，觀察MBIC。

1.4.4 掃描電鏡下觀察AmB 對生物膜作用 分別將單菌種與終濃度分別為0、0.031 25、0.062 50、0.125 00、0.250 00、0.500 00、1.000 00、2.000 00、4.000 00、8.000 00、16.000 00 μg/ml 的AmB 共培養48 h 以細胞爬片建立24 h 單菌種生物膜后再加入不同濃度AmB，PBS 漂洗后戊二醛固定，真空干燥后鍍金，在掃描電子顯微鏡下觀察生物膜變化。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生物膜形成能力測定

除2 號假絲酵母菌在24h 生物膜形成能力為中外，其余各假絲酵母菌在24 h 生物膜形成能力均為強。以48 h 為時間點，5 號及6 號乳桿菌生物膜形成能力為弱，而7 號及8 號乳桿菌生物膜形成能力為強。除1 號假絲酵母菌外，其余白假絲酵母菌及卷曲乳桿菌生物膜形成能力在48 h 高于24 h，差異有統計學意義（P＜0.05）。而除7 號乳桿菌生物膜形成能力48 h高于72 h，差異有統計學意義（P＜0.05）外，其余各菌生物膜形成能力在48 h 與72 h 差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 4 株假絲酵母菌及4 株乳桿菌生物膜形成能力

2.2 MIC 值測定

4 株白假絲酵母菌肉眼未見渾濁培養孔對應藥物濃度均為0.125 00 μg/ml，考慮AmB 對白假絲酵母菌的MIC 值為0.125 00 μg/ml。而AmB 對卷曲乳桿菌未見明顯無渾濁培養孔，后續分別計算抑制率，均未達到80%，故考慮AmB 對卷曲乳桿菌無抑制作用。見表1。

表1 不同濃度AmB 對乳桿菌抑制率（%）

2.3 MBIC 值測定

AmB 對不同白假絲酵母菌的MBIC 值略有不同，2 號假絲酵母菌在AmB 濃度為2 μg/ml 時生物膜形成能力與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余白假絲酵母菌在AmB 濃度為2 μg/ml時低于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），降低至2 μg/ml 后續維持平臺狀態，均與后續各濃度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。考慮Amb 對白假絲酵母菌的MBIC 值為2 μg/ml。

圖2 4 株假絲酵母菌MBIC 測定

2.4 乳桿菌加入不同濃度AmB 生物膜形成能力計算值比較

7 號乳桿菌在AmB 濃度為1、8、16 μg/ml 時生物膜形成能力高于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）外，其余各卷曲乳桿菌在各濃度生物膜形成能力與陽性對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。故考慮AmB 對卷曲乳桿菌已形成的生物膜無破壞作用。

圖3 4 株乳桿菌加入不同濃度AmB 生物膜形成能力計算值比較

2.5 AmB 對白假絲酵母菌生物膜的作用

2.5.1 AmB 對白假絲酵母菌生物膜形成的抑制作用2號白假絲酵母菌單獨培養48 h 后生長及生物膜形成情況見圖4A，同一株菌與0.1 μg/ml AmB 共同培養48 h后的電鏡表現見圖4B，可以見到白假絲酵母菌的數量較單獨培養時減少且形成的生物膜也減少。4 號假絲酵母菌數量減少且形成的生物膜亦有減少，見圖4C～D。

圖4 假絲酵母菌與AmB 共同培養48 h 電鏡表現

2.5.2 AmB 對已形成的白假絲酵母菌生物膜的破壞作用2 號假絲酵母菌單獨培養48 h 后生物膜形成情況見圖5A，同一株菌培養24 h 得到成熟生物膜再與1 μg/ml AmB 共同培養24 h 后生物膜變化情況的電鏡表現見圖5B，可以見到白假絲酵母菌已形成的生物膜較前減少。已形成的生物膜較前減少見圖5C～D。

圖5 AmB 對假絲酵母菌已形成的生物膜作用電鏡表現

2.6 AmB 對卷曲乳桿菌生物膜的作用

2.6.1 AmB 對卷曲乳桿菌生物膜形成的抑制作用5號乳桿菌單獨培養48 h 后生長及生物膜形成情況見圖6A，同一株菌與0.125 00μg/ml AmB 共同培養48 h 后生長及生物膜形成情況的電鏡表現見圖6B，可以見到卷曲乳桿菌的數量較前無明顯改變且形成的生物膜也無明顯改變。

圖6 乳桿菌與AmB 共同培養48 h 電鏡表現

2.6.2 AmB 對已形成的卷曲乳桿菌生物膜的破壞作用5 號乳桿菌單獨培養48 h 后生物膜形成情況見圖7A，為同一株菌培養24 h 得到成熟生物膜再與2 μg/ml AmB 共同培養24 h 后生物膜變化情況的電鏡表現見圖7B，可以見到卷曲乳桿菌已形成的生物膜無明顯減少。5 號乳桿菌放大3000 倍時的電鏡下表現見圖C～D，可以更明顯地看出其所形成的生物膜未被破壞。

圖7 AmB 對乳桿菌已形成生物膜作用電鏡表現

3 討論

VVC 是臨床常見的一種婦科炎癥疾病，而白假絲酵母菌是其中最常見也是致病性最強的致病菌[11]。白假絲酵母菌是一種雙相菌，可在菌絲相與酵母相間相互轉換。在外界環境不利于其繁殖時轉換為抗性更強的酵母相，而在宿主抵抗力下降等情況下轉換為毒力更強的菌絲相，該相的特性使其易于復發[12-13]；同時其形成的生物膜包裹并保護內部的假絲酵母菌，減少抗真菌藥物的穿透，可增強其耐藥性[14]。目前對VVC的治療主要以抗真菌藥物，尤其是唑類藥物為主[2]，但由于反復及不合理應用，其耐藥問題逐漸突顯[15]。

AmB 主要通過與假絲酵母菌細胞膜的麥角甾醇結合，形成貫穿細胞膜的管狀小孔，使核苷酸等細胞內物質外泄，并使細胞毒性物質內滲，從而破壞細胞正常代謝而引起真菌死亡[16-17]；同時可誘導細胞氧化損傷，并刺激細胞產生免疫因子，對女性免疫系統起調節作用等與唑類藥物不同的作用機制[18-19]，在唑類藥物耐藥時仍能起到較好療效。

本研究對白假絲酵母菌生物膜形成能力進行了測定，在48 h 時生物膜形成能力均為強，同時在該時間點測定AmB 對其的MIC 及MBIC 值，這與Borman等[20]研究選擇的時間點是一致的，盡管美國臨床和實驗室標準協會方法學提到將結果判讀時間點由48 h改為24 h，但對于生長較慢的假絲酵母菌除外，故本研究中仍選擇48 h 作為結果判讀時間點[10]。無論生物膜形成能力強或中等的假絲酵母菌，其測得MIC 值均為0.125 00 μg/ml，與既往研究中測得的MIC 值類似[21]，故認為AmB 對白假絲酵母菌有較好的療效，在臨床應用中，唑類藥物耐藥時，可選擇AmB 作為VVC 的治療用藥。同時測得其MBIC 值為2 μg/ml，提示在假絲酵母菌已形成生物膜后，即已感染假絲酵母菌一段時間后，需提升足夠的藥物濃度以起到治療作用。

陰道內存在非常復雜的微生態系統，其中包含數以億計的微生物及病原體[22]，目前對于VVC 的治療，除應用上述抗真菌藥物殺滅病原菌外，恢復陰道有益菌群并增強其功能亦十分重要[23]。目前有研究顯示乳桿菌可通過干擾生物膜及菌絲的形成起到抗假絲酵母菌的作用[24]。Oliveira 等[25]的體外實驗鼠李糖乳桿菌可影響白假絲酵母菌毒力因子的表達，降低蛋白酶和溶血酶活性，降低生物膜形成能力。但在臨床工作中，針對VVC 患者的陰道菌群修復，是采取AmB 與乳桿菌制劑聯合應用還是序貫應用更合適呢？這在以往的應用中經驗不多。乳桿菌制劑可以增加乳桿菌數量，在恢復陰道微生態系統平衡上起重要作用，如采用與抗真菌藥物聯合應用的方法，相較于序貫或單獨應用抗真菌藥物，勢必對縮短治療時間，提高患者依從性與療效及降低復發率有所幫助。本研究發現，AmB 在對假絲酵母菌有抑制作用的同時，不僅無抑制卷曲乳桿菌生長的作用，同時對生物膜形成能力最弱的卷曲乳桿菌已形成的生物膜亦無破壞作用。提示AmB 并不會破壞陰道內正常存在的卷曲乳桿菌，且在應用AmB 的同時可加入乳桿菌制劑以改善陰道微生態環境的平衡。2017 年一項納入了125例VVC 患者的研究比較了氟康唑與乳桿菌制劑聯合應用、序貫應用及單獨應用的療效，發現聯合應用與序貫應用效果類似，均可提高療效并降低復發率[26]。本研究通過體外實驗的方式，提示AmB 對白假絲酵母菌有抑制及破壞生物膜作用的同時，對乳桿菌及其形成的生物膜無抑制及破壞作用，提示AmB 與乳桿菌制劑聯合應用治療VVC 有理論上的可行性。

綜上所述，AmB 對白假絲酵母菌有較強抑菌能力，但對已形成生物膜的白假絲酵母菌需更大劑量才可起到破壞生物膜的作用；對卷曲乳桿菌無抑制及生物膜破壞作用，在臨床應用中可考慮將AmB 與乳桿菌制劑聯合應用，以進一步提高療效。但本研究僅局限于單一菌株的實驗，將假絲酵母菌及乳桿菌共培養是否能進一步減少AmB 的用量，后續還需進一步研究。同時本研究僅局限于體外實驗，如何將AmB 應用于臨床，增加其療效并減少副作用，后續還需進一步研究。