芍藥苷調控RhoA/ROCK2通路對阿爾茨海默病大鼠認知功能障礙的影響

王柳青 魯建華 肖騁 陳夢宇 謝丁玲

(咸寧市中心醫院神經內科,湖北 咸寧 437000)

阿爾茨海默病(AD)是一種發生于老年人群的中樞神經系統退行性疾病,患者腦組織結構和功能隨年齡增長而發生衰老和退化,可嚴重損害患者學習認知能力,極大降低其生活質量,給家庭和社會均帶來很大負擔〔1～4〕。AD的發病機制復雜,補體系統、氧化應激、溶酶體和炎癥等多種物質及病理反應涉及其中,研究發現,清除活性氧(ROS),抑制淀粉樣斑塊引發的小膠質細胞激活,可減輕腦組織神經炎癥和氧化應激損傷,改善AD神經功能減退癥狀〔5,6〕。Ras同源基因家族成員(Rho)A/Rho相關的卷曲螺旋激酶(ROCK)2信號通路在AD的發病及病情進展中起到重要的調控作用,阻滯其信號途徑傳導,可對抗炎癥反應,增強抗氧化活性,降低氧化應激水平,減輕AD大鼠海馬神經元損傷,最終改善其認知功能障礙癥狀〔7,8〕。芍藥苷是一種水溶性單萜苷,提取自芍藥或牡丹根皮中,具有明顯的抗炎、鎮靜、解痙、抗氧化等藥理作用,可有效減輕AD動物模型β-淀粉樣蛋白(Aβ)過度沉積,阻止腦組織炎癥反應和氧化應激反應,減少神經元細胞凋亡,改善AD臨床癥狀〔9,10〕,但芍藥苷是否可通過調控RhoA/ROCK2通路影響AD大鼠認知功能障礙,目前尚未有詳細闡述,本文通過構建AD大鼠模型,對此進行探討。

1 材料與方法

1.1動物 SD大鼠,雄性,SPF級,13～14月齡,體質量350～365 g,購自河北醫科大學動物實驗中心,合格證號501628,許可證號SCXK(冀)2019-8-116。嚴格按照動物飼養規范于咸寧市中心醫院動物中心適應飼養,溫度22.5～25.5 ℃,相對濕度50%～55%,明暗光照以12 h/12 h循環交替。

1.2主要試劑及儀器 Aβ1～42多肽(A99280)購自上海吉至生化科技有限公司;芍藥苷(純度>98%,L07M9Q60533)購自上海源葉生物科技有限公司;Rhosin(HY-12646)購自美國MedChemExpress公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(E607318-0200)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質定量檢測試劑盒(C503021-0500)、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(D799762-0100)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(D799593-0050)、RIPA裂解液(C500005-0050)購自上海生工生物工程股份有限公司;活性氧(ROS)測定試劑盒(E004-1-1)、白細胞介素(IL)-6測試盒(H007)、干擾素(IFN)-γ測試盒(H025)購自南京建成生物工程研究所有限公司;兔源GAPDH一抗(ab181602)、兔源RhoA抗體(ab187027)、兔源ROCK2抗體(ab125025)、羊抗兔二抗(ab150077)購自美國Abcam公司。

水迷宮視頻分析系統(DB001 Morris)購自北京智鼠多寶生物科技有限責任公司;酶標儀(M200 PRO)購自瑞士TECAN公司;超薄切片機(EM UC7)購自德國Leica公司;光學顯微鏡(IX71)購自日本Olympus公司;大鼠腦立體定位注射儀購自日本Narishige公司;垂直電泳轉印系統(1658033)購自美國Bio-Rad公司等。

1.3制備AD模型大鼠及分組給藥 參照文獻〔11〕中方法建立AD模型:以40 mg/kg的劑量腹腔注射進禁食12 h大鼠體內,待大鼠完全麻醉后,剃去頭頂毛發,消毒后剪開暴露顱骨,以骨鉆打開顱骨,通過腦立體定位儀定位海馬CA1區,向其中緩慢注入2 g/L的Aβ1～42多肽溶液2 μl,留針5 min后縫合切口,7 d后通過Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力,當其明顯減弱時,表明AD模型制備合格,隨機分為模型組、芍藥苷(20 mg/kg)組、Rhosin(RhoA抑制劑,40 mg/kg)組、芍藥苷(20 mg/kg)+Rhosin(40 mg/kg)組,另外選取12只SD大鼠,以同樣操作向其海馬CA1區注射2 μl生理鹽水作為假手術組。

以生理鹽水溶解芍藥苷與Rhosin配制藥液,得到4 mg/ml的芍藥苷藥液〔12〕、8 mg/ml的Rhosin藥液〔13〕、濃度分別為4、8 mg/ml的芍藥苷和Rhosin混合藥液,藥物干預組大鼠均以5 ml/kg的劑量腹腔注射,假手術組和模型組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水,用藥1次/d,共持續用藥21 d。

1.4Morris水迷宮實驗 末次用藥結束后24 h,參照文獻〔14〕中方法進行Morris水迷宮實驗,訓練大鼠自水池的4個象限尋找平臺,到第6天時測定大鼠逃避潛伏期,即大鼠自入水直至找到水下平臺所花費時間,超過90 s仍未找到平臺的大鼠,逃避潛伏期記為90 s,重復測量3次,取平均值。

1.5檢測大鼠海馬組織病理形態及收集標本 水迷宮實驗結束后,使用乙醚氣體麻醉大鼠,采用2 ml注射器吸取頸動脈血1.2 ml,轉入離心管中4 ℃離心,小心吸出上清,分組標記后存在-80 ℃備用;將大鼠斷頭處死,剝離出大腦,每組隨機選出6個大腦,分離出海馬組織,轉移至凍存管中,標記組別后存在液氮中備用;各組剩余的6個大腦,做清洗、固定、脫水、包埋處理后,采用切片機切為連續冠狀切片,選出含有清晰海馬結構的薄片,進行脫蠟、水化處理,使用試劑盒按照其說明書指導步驟進行HE染色,以蒸餾水漂洗后,轉移至載玻片上封片,使用光學顯微鏡觀察海馬組織病理形態,并任意選出5個視野拍照。

1.6檢測大鼠海馬組織SOD、ROS、MDA水平和血清IL-6、IFN-γ含量1.5中的血清,提前取出以冰水浴解凍,采用試劑盒按照其各自說明書指導步驟測定各組IL-6、IFN-γ含量。1.5中的海馬組織取出,加入RIPA裂解液,通過勻漿、離心提出總蛋白,以BCA法測出其濃度后,每組各取120 μl,采用試劑盒按照其各自說明書指導步驟測定其中SOD、ROS、MDA水平。

1.7Western印跡檢測各組大鼠海馬組織RhoA/ROCK2通路相關蛋白表達 取出1.6中剩余的蛋白樣品液,均煮沸(100 ℃)5 min變性,通過電泳(110 V,90 min)將20 mg各組蛋白分離開,并通過濕轉(400 mA,60 min)轉移至硝酸纖維素膜上,然后以5%脫脂奶粉封閉其非特異位點(37.5 ℃,90 min),將RhoA、ROCK2、GAPDH 3種目的蛋白條帶裁下,以對應一抗溶液孵育(4 ℃,12 min),TBST洗膜3次(5 min/次),以羊抗兔二抗溶液孵育(37.5 ℃,90 min)后,以同樣操作再次洗膜,將蛋白條帶顯色后拍照,并采用Quantity One軟件對其灰度進行定量后統計,最終得出各組蛋白相對表達。

1.8統計學分析 采用GraphPad Prism6.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組認知功能 與假手術組相比,模型組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05);與模型組相比,藥物干預組逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期、IL-6、IFN-γ、MDA含量及SOD、ROS活性比較

2.2各組海馬組織病理形態檢測結果 假手術組海馬組織結構完好,神經元形態及排列正常;模型組神經元細胞結構萎縮,變性死亡,排列紊亂疏松,數目明顯減少,海馬組織呈現明顯損傷;與模型組相比,藥物干預組海馬組織上述病理損傷均減輕;與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組海馬組織上述病理損傷均進一步減輕。見圖1。

圖1 各組海馬組織神經元(HE染色,×400)

2.3各組海馬組織SOD和ROS、MDA含量 與假手術組相比,模型組海馬組織SOD活性顯著降低(P<0.05),ROS、MDA含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物干預組海馬組織SOD含量明顯升高,ROS、MDA含量均明顯降低(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組海馬組織SOD含量明顯升高,ROS、MDA含量均明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量 與假手術組相比,模型組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物干預組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量均顯著降低(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組血清致炎因子IL-6和IFN-γ含量均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.5各組海馬組織RhoA/ROCK2通路相關蛋白表達水平 與假手術組相比,模型組海馬組織RhoA、ROCK2蛋白表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物干預組海馬組織RhoA、ROCK2蛋白表達均顯著降低(P<0.05);與芍藥苷組、Rhosin組相比,芍藥苷+Rhosin組海馬組織RhoA、ROCK2蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。

1～5:假手術組、模型組、芍藥苷組、Rhosin組、芍藥苷+Rhosin組圖2 各組海馬組織RhoA/ROCK2通路相關蛋白的Western印跡檢測

表2 各組海馬組織RhoA/ROCK2通路相關蛋白相對表達水平

3 討 論

Aβ引發的炎癥級聯反應是AD發生的經典假說,證據表明,Aβ多肽可誘導腦組織發生明顯的炎癥和氧化應激損傷,導致Aβ大量沉積腦內形成斑塊,誘導神經元凋亡丟失,損害AD模型大鼠學習記憶功能〔15,16〕。本文結果表明,Aβ1～42多肽可誘導ROS與炎性細胞因子大量合成釋放,降低內源性抗氧化活性,引發強烈過氧化及炎癥反應,導致海馬神經元死亡缺失,造成大鼠認知功能障礙,揭示AD模型構建成功。

目前臨床中常用的AD治療藥物,無法從根本上阻止疾病進展,還存在一定副作用,而中藥因其安全性在AD的防治中得到越來越多的重視,芍藥苷是具有明顯消炎抑菌、減輕過氧化與應激反應功效的單萜苷類化合物,可有效抑制氧化應激及炎性反應,減輕脂多糖誘導的急性腦損傷,并保護腦缺血再灌注大鼠神經功能〔17,18〕,還可有效抑制Aβ斑塊形成,修復神經遞質正常平衡,明顯改善AD記憶能力減退癥狀〔8〕,本文結果表明,芍藥苷可提升AD大鼠抗氧化活性,減輕其腦組織炎癥及過氧化損傷,改善認知功能,進一步證實了芍藥苷對AD的療效。

RhoA/ROCK2是觸發炎性級聯反應的重要信號,隨著老化進展,其信號蛋白在腦組織中表達顯著增加,下調RhoA/ROCK2通路蛋白表達,可對抗Aβ多肽誘導的炎癥級聯反應,降低氧化應激水平,延緩神經突觸丟失,促使神經元細胞存活,提升衰老造成的學習記憶功能減退,改善其認知能力〔19,20〕,由此可知,RhoA/ROCK2信號是防治AD的重要作用靶點,本文結果表明,Rhosin能增強芍藥苷對AD的治療效果,揭示芍藥苷可能通過抑制RhoA/ROCK2通路激活改善AD大鼠認知功能障礙。

綜上所述,芍藥苷可下調RhoA及ROCK2蛋白表達,增強AD大鼠抗氧化活性,抑制其腦組織炎癥產生,降低氧化應激水平,減輕海馬神經元凋亡缺失,修復大鼠學習記憶能力,改善其認知功能,為芍藥苷在AD臨床治療上的推廣應用提供了新的有力證據,并探討了其藥理機制,后續會通過激活RhoA/ROCK2通路做更深入的研究。