基于TGF-β/Smads通路分析上調miR-34b對前列腺癌模型大鼠的影響

田景昌 田兵 宗德斌 李猛 李勇 胡明宇 薛佐興 荊孝東

(大連大學附屬新華醫院泌尿外科,遼寧 大連 116021)

前列腺癌為男性常見惡性腫瘤,早期無明顯癥狀,易被忽略〔1,2〕,主要臨床表現為夜尿增多、尿頻、尿痛、尿急等。前列腺癌與其他不同部位癌癥有相同的治療原則,要早期發現,早期診斷,早期治療〔3,4〕。臨床治療主要以根治性放射及根治性手術治療為主。近年來我國前列腺癌發病率居高不下,如何有效治療仍是臨床研究熱點〔5〕。微小 RNA(miRNA) 在前列腺癌中具備一定的機制作用,miR-34b屬于微小 RNA家族的一員,但現今研究中對于miR-34b在前列腺癌中的相關機制研究報道較為稀少〔6〕?；谏鲜霰尘?本文分析上調miR-34b對前列腺癌模型大鼠細胞外信號調節轉化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路的影響,以明確 miR-34b 是否經 TGF-α/Smads 信號通路影響并調控前列腺癌的發生及發展,具有一定的創新性。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠〔河北中旭檢驗檢測技術有限公司,使用許可證號:SYXK(冀)2020-009〕,7～10周齡,平均(8.6±1.2)周齡;體質量216～240 g,平均(227.9±9.6)g。于(23.8±3.1)℃環境中喂養大鼠。本研究獲醫院倫理委員會批準。主要試劑:兔抗大鼠白細胞介素(IL)-1抗體(Selleck公司);小鼠抗大鼠血管內皮生長因子(VEGF)抗體(Invitrogen公司);兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、基質金屬蛋白酶(MMP)-3抗體(Hyclone公司);小鼠抗兔總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)抗體(Gibco公司);大鼠抗小鼠Toll樣受體(TLR)4(BD公司);小鼠抗兔TGF-β/Smads抗體(Sigma公司)。

1.2建模及分組 隨機挑選10只大鼠為正常組,不做任何處理。其余30只建立前列腺癌模型:大鼠禁食12 h后進行麻醉處理,開腹使大鼠前列腺暴露于術野,使用無菌棉對大鼠前列腺組織進行保護,向兩側前列腺側葉注射小鼠前列腺癌細胞(RM-1)懸液10 μl,包膜鼓起且脫離腺體,注射成功,將無菌棉取出后關腹。大鼠麻醉蘇醒后使用2 mg/kg的絲裂霉素磷酸鹽緩沖液(PBS)腹腔注射,小鼠出現蜷縮、體溫下降等瀕死狀態,經眼眶取血后脫頸處死,表示建模成功,建模過程中死亡3只,最終建模成功27只。將27只前列腺癌大鼠隨機分為模型組、上調組、下調組各9只,上調組尾部靜脈注射30 mg/kg激活胱天蛋白酶富集域家族成員(agoCARD)9,下調組尾部靜脈注射30 mg/kg抑制ago-CARD9(antagoCARD9),正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水,均連續給藥干預7 d。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色 實驗結束后,采集靜脈血,離心,取上清,-20 ℃保存備用。立即處死大鼠,取大鼠前列腺組織,放于10%甲醛中固定,切片,脫蠟操作,HE染色,光學顯微鏡觀察病理組織形態變化。

1.4雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定VEGF、IL-1、TNF-α、ALP水平 將前列腺組織標本加入適量生理鹽水搗碎,3 000 r/min離心10 min取上清液。分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔,將樣品加入96孔酶標板中,每孔50 μl,隨后將其樣品加于至酶標板孔的底部位置,在進行加入的過程中對于孔壁盡量不要去觸碰,搖勻,封板,置于37 ℃常溫中進行孵育30 min。洗板3次,除去空白孔,其余的兩孔內均分別加入50 μl的酶標試劑,37 ℃溫育30 min。洗板3次,在3孔中按照先后順序先加入50 μl的顯色劑A,再加入50 μl的顯色劑B,在37 ℃常溫中進行溫育30 min。每孔加入終止液50 μl,終止反應,此時藍色立轉黃色。以空白孔凋零,450 nm波長計算VEGF、IL-1、TNF-α、ALP水平。

1.5TC、TG、PSA、MMP-3水平檢測 TC、TG水平采取羅氏c501全自動生化分析儀檢測。采用羅氏公司的cobas e 602 全自動電化學發光免疫分析儀測定PSA、MMP-3水平。

1.6miR-34b表達檢測 采用實時熒光定量PCR法測定。細胞轉染成功,Trizol法提取細胞中總RNA,應用mRNA逆轉錄試劑盒行逆轉錄獲得cDNA,GAPDH為內參,提取細胞總RNArimer5.0軟件設計引物反應條件:16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min,40個循環,2-△△Ct方法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次,取平均值。miR-34b上游引物:5′-TTTTTATTTGTTTTGTTTTGTGTTTGTTTTG-3′,下游:5′-CAACTACAACTCCCAAACA-ATCC-3′;內參基因U6:上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATAT-ACTAAAAT-3′,下游:3′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5′。

1.7TGF-B/Smads通路蛋白相對表達量對比 采用Western印跡法對所有培養的細胞進行離心、蛋白提取,然后使用BCA做蛋白定量測定,將50 μg蛋白加入至2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中,轉膜、取膜、固定、做電泳1.5 h封閉處理,將1∶1 000比例的TBST稀釋的TGF-B/Smads一抗,在4 ℃的環境中孵育過夜,TBST反復3次洗膜,將1∶10 000 TBST稀釋的二抗加入,搖動孵育1 h,TBST反復3次洗膜,二氨基聯苯胺(DAB)做顯色處理,定量分析蛋白表達情況,以GAPDH蛋白為內參。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1各組前列腺組織病理學觀察 如圖1所示,正常組前列腺組織細胞結構完好,無充血、水腫等病理變化,無炎性細胞浸潤;模型組前列腺組織細胞排列無規則,且大量壞死,充血、水腫、炎性細胞浸潤情況較明顯;上調組前列腺組織細胞水腫、炎性浸潤現象改善,病變緩解;下調組前列腺組織細胞壞死、充血、水腫、炎性細胞浸潤等病理變化更為嚴重。

圖1 各組前列腺組織(HE染色,×200)

2.2轉染效率鑒定 如表1所示,與正常組相比,模型組、上調組、下調組miR-34b表達量降低,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組miR-34b表達量升高,下調組miR-34b表達量降低,具有統計學差異(P<0.05);與上調組相比,下調組miR-34b表達量降低,具有統計學差異(P<0.05),說明miR-10a轉染成功。

表1 各組轉染效率、骨轉移相關指標、VEGF水平及免疫炎癥因子水平對比

2.3各組血清PSA、VEGF、ALP水平對比 如表1所示,與正常組相比,模型組、上調組、下調組ALP水平降低,PSA、VEGF水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組PSA、VEGF水平下降,ALP水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與上調組相比,下調組ALP水平降低,PSA、VEGF水平升高,具有統計學差異(P<0.05)。

2.4各組免疫炎癥因子水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、上調組、下調組IL-1、TNF-α、MMP-3水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組、下調組IL-1、TNF-α、MMP-3水平降低,具有統計學差異(P<0.05);與上調組相比,下調組IL-1、TNF-α、MMP-3水平升高,具有統計學差異(P<0.05)。

2.5各組血脂水平對比 如表2所示,與正常組相比,模型組、上調組、下調組TC、TG水平升高,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組、下調組TC、TG水平降低,具有統計學差異(P<0.05);與上調組相比,下調組TC、TG水平升高,具有統計學差異(P<0.05)。

表2 各組血脂水平對比

2.6各組TGF-B/Smads通路蛋白表達對比 如表3、圖2所示,與正常組相比,模型組、上調組、下調組TGF-β、Smads表達降低,具有統計學差異(P<0.05);與模型組相比,上調組、下調組TGF-β、Smads表達上升,具有統計學差異(P<0.05);與上調組相比,下調組TGF-β、Smads表達降低,具有統計學差異(P<0.05)。

表3 各組TGF-β/Smads通路蛋白表達對比

圖2 4組TGF-B/Smads通路蛋白表達

3 討 論

前列腺癌的發病病因目前尚未明確,晚期預后不佳〔7〕。研究顯示,抑制癌細胞增殖,促進癌細胞凋亡是治療前列腺癌研究熱點〔8〕。隨著臨床對miRNA的進一步研究顯示,miRNA在轉錄水平上具有抑制該靶基因mRNA的翻譯或降解目標mRNA來調控蛋白質表達的作用〔9〕。miRNA是一種非編碼RNA,廣泛存在于多種生物中,在動物種系中具有保守序列,在血清、血漿中存在較穩定,因此miRNA可應用于診斷腫瘤的潛在血清標志物〔10〕。mRNA可結合靶序列對基因表達產生調節,miRNA在腫瘤的發生中類似于致癌基因和抑癌基因〔11,12〕。相關研究發現,miR-34的異常低表達可使miR-34b下游靶基因水平降低,導致腫瘤增殖,表明調控miR-34可有效抑制癌細胞生長、分化〔13〕。研究發現,miR-34在多種腫瘤(乳腺癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌等)中表達均呈異常低表達,分析原因可能與基因啟動子區甲基化改變相關〔14,15〕。本研究顯示,miR-34b在前列腺癌組織中呈低表達水平,可能與DNA損傷的修復情況有關。報道顯示,miR-34b參與列腺癌局部炎癥反應,當炎癥誘發列腺損傷后可經基因調控作用和介導促進炎癥細胞因子表達參與炎癥損傷,表現為表達異常升高〔16〕。本研究結果顯示,上調miR-34b可有效抑制局部炎癥反應,證實miR-34b對前列腺損傷具有良好保護作用。

研究顯示前列腺癌大鼠TGF-β/Smads蛋白表達降低〔17〕。TGF-β作為功能細胞因子,在干細胞分化及T細胞調節和分化中發揮至關重要作用。研究發現,TGF-β作為一種有效的腫瘤抑制因子,對惡性腫瘤細胞的增殖、促進、凋亡具有良好的抑制作用,在眾多生物學過程中具有重要作用〔18〕。分析其原因可能是其通過細胞突變來影響TGF-β信號通路,將細胞轉化為惡性狀態,產生基質修飾劑進而促進腫瘤的進展和轉移〔19〕。TGF-β/Smad的信號轉導是通過由膜結合的Ⅰ、Ⅱ型受體和Smad蛋白形成低聚體復合物參與轉錄反應的。而Smads家族蛋白在TGF-β信號傳導過程中起到關鍵性作用,且不同的Smad介導不同的TGF-β家族成員的信號轉導〔20,21〕。TGF-β作為配體形成的受體復合物,通過激活Smads進入核內,共同激活或抑制它們調節的靶基因的轉錄。本研究結果提示,上調miR-34b可能通過抑制TGF-β/Smads信號轉導通路表達進而降低細胞增殖能力。

綜上所述,上調miR-34b可有效抑制局部炎癥反應蔓延,延緩前列腺癌骨轉移進展,改善PSA、VEGF、MMP-9及血脂的水平,分析其機制可能是TGF-β/Smads通路蛋白表達受到調控。因此miR-34b可作為前列腺癌新的治療靶點,可進一步進行深入研究。