檉柳根際土壤放線菌的分離及拮抗活性篩選

2023-07-28 13:32:26陳乙煌東珍珍馬小梅黃建軍羅曉霞

新疆農業科學 2023年7期

陳乙煌,邢利,東珍珍,馬小梅,黃建軍,羅曉霞

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300,2.新疆阿拉爾市十三團農業發展服務中心,新疆阿拉爾 843300)

0 引言

【研究意義】放線菌是農業生態系統中防治病蟲害的重要微生物資源[1-2]。塔里木盆地在干旱極端環境下孕育著具有耐旱抗鹽的荒漠植物。檉柳是新疆植被中的主要物種之一,主要分布在塔里木盆地,挖掘檉柳土壤微生物資源,對于新疆主要農牧業病害的防控及保護和利用新疆極端環境放線菌資源具有重要意義。【前人研究進展】張金輝等[3]從阿勒泰福海縣周邊檉柳根際土樣中分離得到的噬鹽糖多孢菌A-064對番茄早疫病菌等具有較強抑制作用。【本研究切入點】以檉柳根際土壤為材料,分離檉柳根際放線菌[4-5],以細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylohydrolytic)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi),以及植物病原真菌白色念珠菌(Candidaalbicans)、鏈格孢(Alternariatenuissima)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)為靶標菌進行拮抗活性放線菌生物篩選。【擬解決的關鍵問題】選擇新疆南疆地區10種檉柳根際土壤的放線菌資源,采用四種培養基,研究新疆塔里木盆地放線菌資源代謝產物的多樣性,為農牧業病害防治提供更多藥物先導化合物的生產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

采集新疆南疆地區10種不同地點的檉柳根際土壤樣品于無菌樣品盒子中,置于4℃保存,備用。表1

表1 土壤樣品信息

1.1.2 供試靶標菌

以革蘭陽性細菌代表種S.aureus,E.coli,P.aeruginosa,K.pneumonia,E.amylohydrolytic,S.typhi,C.albicans,A.tenuissima,V.dahliae,F.oxysporum為靶標菌保存于新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室。

1.1.3 培養基

(1)高氏一號培養基[6];(2)5號培養基:蛋白胨5 g,酵母提取物1 g,檸檬酸鐵0.1 g,NaCl 19.45 g,MgCl25.9 g,Na2SO43.24 g,CaCl21.8 g,KCl 0.55 g,NaHCO30.16 g,KBr 0.08 g,SrCl234 mg,H3BO322mg,硅酸鈉 4 mg,NaF 2.4 mg,NH4NO31.6 mg,Na2HPO48 mg,瓊脂16 g,蒸餾水1 L,pH 7.0～7.5;(3)8號培養基:可溶性淀粉10 g,燕麥片10 g,(NH4)2SO42 g,K2HPO41 g,MgSO41 g,NaCl 1 g,CaCO32 g,微量元素溶液 1 mL,瓊脂 16 g,蒸餾水 1 L,pH 7.2;(4)甘油精氨酸培養基[7];(5)TSB液體培養基[8];(6)MHA(MHB)培養基用于細菌的培養和拮抗活性篩選[9];采用SDA(SDB)培養基用于白色念珠菌的培養和拮抗活性篩選[9];(7)OA(OB)培養基用于鏈格孢的培養和拮抗活性篩選[10];(8)PDA(PDB)培養基用于棉花枯黃萎病菌的培養和拮抗活性篩選[11]。

1.1.4 主要儀器

PCR 儀:SENSO,德國;凝膠成像儀器ChemDoc XRS+:伯樂公司,美國;超凈工作臺SW-CJ-2F:博迅,上海;電泳儀DYCZ-26C:六一儀器廠,中國;電熱恒溫水浴鍋DHP-9272:一恒,上海;離心機Centrifuge 5415 D:Eppendorf,德國。

1.2 方法

1.2.1 根際土壤放線菌的分離

稱取1 g土壤樣品置于9 mL無菌的生理鹽水,充分振蕩混勻,即為10-1土壤懸濁液;依次稀釋10倍,采用倍性稀釋法分別配置成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6土壤懸濁液。以不同區域樣品為材料,采用iChip[12]技術,選取高氏一號培養基,5號培養基,8號培養基,甘油精氨酸培養基進行放線菌的分離培養[13-17],以上培養基中加入重鉻酸鉀,放線菌酮,萘啶酮酸和制霉菌素以抑制細菌和霉菌的生長,于28℃恒溫培養箱中倒置培養3～20 d,分離到的放線菌[13-14]經純化培養,收集于20%甘油中,在-80℃冷凍保存。

1.2.2 檉柳根際土壤菌株的鑒定

采用CTAB法提取放線菌的基因組DNA,以基因組DNA為模板,以27F和1 492R為引物,引物序列27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR擴增,送樣測序。將測序后的16S rDNA序列提交到EzBiocloud(http://www.ezbiocloud.net),對16S rDNA 進行相似性比對搜索,判斷菌株種類。選取相似序列,到NCBI的blast(Basic Local Alignment Search Tool,序列對比工具) 工具比對,分析菌株的相似性,使用MEGA 7.0[18],選擇GenBank中與之同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列,以塔里木大學菌株排序為編號構建菌株 Neighbor- Joining系統發育樹進行系統發育分析。

1.2.3 拮抗活性篩選

分離的放線菌劃線培養制成菌餅備用。(1)細菌活性篩選:將靶標菌接種至MHB液體培養基中,37℃,180 r/min搖床培養8 h,吸取菌液加入到 MHA培養基中,混勻倒板。將分離的放線菌菌餅分別接入,置于37℃培養箱中培養18 h。(2)真菌活性篩選:靶標菌為白色念珠菌,棉花黃萎,鏈格孢時分別用SDA,PDA,OA培養基培養,分別接種至液體培養基中,28℃,180 r/min搖床培養72 h,將靶標菌菌懸液涂布培養,接入菌餅,置于28℃培養箱中培養72 h。觀察其抑菌活性及計算抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 檉柳根際土壤菌株的分離

研究表明,共分離獲得放線菌294株,不同地點的檉柳根際土壤樣品分離的放線菌數量有明顯不同,HT51檉柳根際土壤樣品分離的菌株最多,共有118株;HT49檉柳根際土壤樣品次之,共有89株;HT53檉柳根際土壤樣品和HT65檉柳根際土壤樣品最少,0株。

甘油精氨酸培養基分離出的菌株最多,共有119株;其次是高氏一號培養基,共有80株;5號培養基最少,共有33株。甘油精氨酸培養基和高氏一號培養基較適合分離其根際土壤放線菌。圖1

注:A:不同土壤樣品分離的菌株數量;B:不同培養基分離的菌株數量

2.2 檉柳根際土壤菌株的鑒定

研究表明,檉柳根際土壤菌株分屬于7個綱12個目16科24個屬,24個屬分別是鏈霉菌屬(Streptomyces)、小單胞菌屬(Micromonospora)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、農桿菌屬(Agrobacterium)、微桿菌屬 (Microbacterium)、無色桿菌屬(Achromobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、產堿桿菌屬 (Alcaligenes)、副根瘤菌 (Paramesorhizobium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、沙門氏菌 (Salmonellaenterica)、從毛單胞菌屬(Comamonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、新根瘤菌(Neorhizobium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、香味菌屬(Myroides)、博代氏桿菌屬(Bordetella)、葉狀桿菌屬(Phyllobacterium)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、居海綿粉色桿狀菌(Roseivirga)、劍菌屬(Ensifer)。除鏈霉菌以外的稀有放線菌包括小單孢菌,微桿菌和纖維菌屬。圖2

注:A:16S rDNA電泳圖 B:16S rDNA序列擴增電泳圖(M:為maker,P為陽性,N為陰性)

鑒定的150株菌株中,有9株相似度小于98.65%,為潛在新物種。將9個潛在新物種歸屬于3個屬,分別是Paramesorhizobium,Streptomyces,Pseudonocardia等3個屬的潛在新物種。其中TRM 76038與ParamesorhizobiumdesertiA-3-E相似性98.26%,為Paramesorhizobium;TRM 76037與StreptomycescoeruleorubidusISP 5145相似性98.06%,為Streptomyces;TRM 76012與ParamesorhizobiumdesertiA-3-E相似性97.89%,為Paramesorhizobium;TRM 76006與StreptomycesalbogriseolusNRRL B-1305相似性98.59%,為Streptomyces;TRM 76011與StreptomycesgossypiisoliTRM 44567相似性97.43%,為Streptomyces;TRM 76023與StreptomyceslongispororuberNBRC 13488相似性98.64%,為Streptomyces;TRM 76246與Pseudonocardiazijingensis6330相似性98.65%,為Pseudonocardia;TRM 76249與StreptomycesasenjoniiKNN 35.1b相似性98.26%,為Streptomyces;TRM 76070與StreptomycesniveoruberNBRC 15428相似性98.51%,為Streptomyces。圖3

圖3 基于16S rDNA序列構建檉柳根際

2.3 檉柳根際土壤放線菌的拮抗活性篩選

研究表明,對E.coli有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101對E.coli的抑菌作用最強,抑菌圈達到17 mm;對S.aureus有拮抗活性菌株有8株,TRM 76185和TRM 76130對S.aureus病原菌的抑制作用最強,抑菌圈直徑達到18 mm;對P.aeruginosa有拮抗活性菌株有11株,TRM 76072對P.aeruginosa的抑制作用最強,抑菌圈直徑達到20 mm;對K.pneumonia有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101對K.pneumonia的抑制作用最強,抑菌圈達到16 mm;對E.amylohydrolytic有拮抗活性菌株有9株,TRM 76187對E.amylohydrolytic的抑菌作用最強,抑菌圈達到16 mm;對S.typhi有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101對S.typhi的抑菌作用最強,抑菌圈達到16 mm;對C.albicans有拮抗活性菌株13株,TRM 76101對C.albicans的抑菌作用最強,抑菌圈達到22 mm;對A.tenuissima有拮抗活性菌株有47株,TRM 76177對A.tenuissima的抑菌作用最強,抑菌圈達到25 mm;對V.dahliae有拮抗活性菌株有16株,TRM 76156對V.dahliae的抑菌作用最強,抑菌圈達到30 mm;對F.oxysporu有拮抗活性菌株有12株,TRM 76159對F.oxysporu的抑菌作用最強,抑菌圈20 mm。篩選的150株檉柳根際土壤放線菌中,具有抗菌活性的放線菌有68株,約占鑒定總數的46%。表2

3 討論

3.1對分離的294株菌株經初步排重后,篩選后鏈霉菌為優勢類群,與夏占峰等[19]潘文娟等[20]所得的結果相符。選用了V.dahliae等為靶標菌,可以運用當地微生物資源去解決當地農作物生產過程中所遇到的植物真菌感染問題。

3.2對于不同靶標菌的抑制,檉柳根際土壤的放線菌對A.tenuissima有抑制作用的數量最多,對V.dahliae病原菌有抑制作用的放線菌數量其次。菌株來源不同,對病原菌的抑制作用也會有不同,表現出土壤樣品種類和地域方面的差異,與王婧等[21]所得結果相符合。TRM 76063和TRM 76033雖然16S rDNA基因序列相似性都是99.56%,但是其抑菌活性差異又很大,在拮抗活性篩選時,不同土壤樣品的同一物種的菌株,活性也會不同,即為同一物種的菌株活性有差異。