26個鮮食棗品種SSR指紋圖譜構建與遺傳多樣性分析

張雁飛,蘇比娜·肖克來提,楊 磊,郝 慶,靳 娟,樊丁宇

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所/農業部新疆地區果樹科學觀測實驗站,烏魯木齊 830091;2.新疆農業大學園藝學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】棗(ZiziphusJujubaMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZiziphusMill.)植物,原產中國[1]。棗具有良好的生態和經濟效應,適應性廣,已育成800多個棗樹品種[2]。但棗樹品種和類型命名較混亂,尤其是在同音異義詞和同義詞的使用上。鮮食棗品種冬棗有20多個不同的地方名稱。需要建立一套準確鮮食品種鑒定方法?！厩叭搜芯窟M展】農作物的品種鑒定方法主要包括生化鑒定法、物理化學鑒定法、形態學鑒定法和DNA分子標記法[3]。前3種鑒定方法耗時長,且易受環境因素的影響;而運用DNA分子標記法來進行種質和品種鑒定,具有快速、高效和準確的優點[4]。SSR(Simple sequence repeat,簡單重復序列)廣泛分布于真核生物基因組中[5],因其高多態性、共顯性、穩定性和適于自動化分析等特點,被廣泛應用于種質資源保護、遺傳多樣性分析、親緣關系研究、遺傳作圖、DNA指紋分析和分子標記輔助育種等領域[6]。麻麗穎等[7]利用從冬棗中開發的12對SSR引物,分析36份棗種質,構建了36份棗品種的指紋圖譜,為棗樹分類、種質鑒定和分子育種提供了重要的工具。原勤勤等[8]分析38份棗樹品種遺傳多樣性,其多態性比率為88.47%。殷曉等[9]利用SSR標記分析了陜北54份棗種質的遺傳結構,在分子水平上研究陜北棗品種群遺傳結構表明,陜北棗屬于中度雜合,遺傳多樣性豐富,供試品種交流頻繁,遺傳多樣性與品種間親緣關系之間有密切的聯系。江錫兵[10]、艾呈祥[11]等利用SSR分子標記對栗雜交F1代進行了遺傳多樣性分析,多樣性指數為0.881 6～1.131 7,其子代均有豐富的遺傳多樣性?！颈狙芯壳腥朦c】對各類棗樹鑒定的相關研究已有很多,但未有專為鮮食棗品種鑒定的方法總結,需研究種質為保存于新疆的26份鮮食棗種質資源,通過該試驗來構建棗品種DNA指紋圖譜。【擬解決的關鍵問題】研究利用22對SSR引物構建26份鮮食棗種質資源指紋圖譜,分析其遺傳多樣性,為鮮食棗品種鑒定和遺傳多樣性分析提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

26份鮮食棗品種資源保存在新疆葉城果樹科學觀測實驗站棗資源圃。采集26個棗品種的幼嫩葉片,利用改良CTAB方法提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳及微量分光光度計檢測質量和濃度,并將樣液保存于-20℃冰箱待用。表1

表1 26份鮮食棗品種名稱及產地來源

22對SSR引物序列由北京林業大學林木育種國家工程實驗室龐曉明課題組開發提供,由上海派森諾基因科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 SSR-PCR擴增體系

利用三引物法PCR(即在5′端加有M13 尾巴序列的特異正向引物、特異反向引物及帶有熒光標記的通用型M13 引物,利用毛細管電泳技術可以同時檢測不同熒光染料標記的多個SSR 位點)擴增SSR 位點。

SSR-PCR反應為20 μL體系,包含1 μLDNA 模板,各1 μL 正反向引物,2 μL 10*Buffer,0.5 μL dNTP, 0.5 μLTaq酶,14 μL ddH2O。

PCR 擴增程序按以下步驟進行:首先95℃預變性5 min;其次95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環10次;隨后95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環25 次;最終72℃延伸7 min。PCR產物中加入LIZ 500與HiDi內標,震蕩充分混勻,瞬離以除去管壁樣品;經95℃變性4 min后迅速移至冰上冷卻,放置于ABI 3730 XL全自動DNA測序儀內進行毛細管電泳檢測,用Gene-Marker軟件(Soft Genetics LLC,USA)進行數據分析。表2

表2 SSR引物信息

1.2.2 指紋圖譜構建

參考麻麗穎等[7]方法構建指紋圖譜。以所分析的SSR引物名稱為前綴,該標記在某樣品上擴增帶的分子量為后綴,得到每個品種在某個標記的帶型編號。按照固定的引物排序綜合不同引物分析結果,串聯各帶型編號,形成該品種的SSR指紋圖譜。

1.3 數據處理

依據凝膠結果同一位置有無條帶進行賦值,有條帶賦值記為“1”,無條帶則賦值記為“0”,根據賦值在Excel中建立26份材料的 “0-1”矩陣。計算不同群體的等位基因數(Allele number,Na)、有效等位基因數(Effective number of allele,Ne)、Shannon’s 信息指數[12](Shannon’s information index,I)和觀察雜合度(Heterozygosity,Ho)等進行對比分析,計算引物多態性信息含量(Polymorphism information content,PIC)[13]。通過NTSYS軟件進行遺傳相似性分析并計算遺傳相似系數(Genetic identity,GI)和遺傳距離(Genetic distance,GD)。采用UPGMA(非加權配對法)聚類分析,在樹狀圖中構建26份棗品種之間基于遺傳相似性的遺傳關系。

2 結果與分析

2.1 毛細管電泳結果

研究表明,利用22對SSR引物對26份棗品種進行多態性分析。22對SSR標記在26個品種中共擴增出130條等位片段,平均每對引物能擴增到5.909個,其中BFU1279和BFU0308擴增的等位基因數最多,為10個;BFU0263和BFU0614擴增的等位基因數最少,為2個。各引物的多態信息含量(PIC)變幅為0.237 7～0.855 6,平均為0.59。平均每個位點觀測等位基因數(Na)為5;有效等位基因數(Ne)為3.776;雜合度(Ho)為0.927;Shannon信息指數(I)為1.371。表3

表3 22對SSR引物多態性信息及其遺傳參數

2.2 指紋圖譜構建

研究表明,3對SSR引物組合(BFU00308、BFU1157和 BFU0547)就可以將26份棗品種完全區分開。其中引物 BFU0308和BFU1157的區分能力最強,多態位點數分別達10和9個,可以區分京滄6號、京滄8號、賽蜜酥1號和迎秋紅等26個品種。表4

表4 26個棗品種的SSR指紋圖譜

2.3 聚類分析

研究表明,26份棗品種的遺傳相似系數在0.65～1.00,平均相似系數為0.83。在遺傳相似系數0.65處可將26個品種分為兩大類。第一大類包括24個品種,其中秦820(8)與早冬1號(11)相似系數最大,2個品種之間有很近的親緣關系;依次親緣關系較近的迎秋紅(10)和京39(22),京滄8號(6)和阜帥(7)之間的遺傳相似系數為0.97;玉嬌(2)、懶漢冬棗(25)、圓鈴2號(20)和賽蜜酥1號(5)都與金絲小棗(S26)聚成了一個小類群;ZS9和雨帥也聚在了一個小類群內,遺傳相似系數達到0.86,2品種之間的親緣關系近;第二大類包括兩個品種,金芒果棗(15)和美蜜棗(24)與其它 24個品種的遺傳相似系數都比較低,在0.6左右,與其他品種具有較遠的親緣關系。圖1

圖1 26個紅棗品種的聚類

3 討 論

SSR(簡單重復序列)和單核苷酸多態性(SNPs)已經成為植物遺傳分析和標記輔助育種的主要標記[14-16]。然而,對于研究較少的植物,如棗樹,開發SNPs的成本很高,目前只有幾個SSR標記被報道為闡明遺傳多樣性的優越分子工具[17-18]。SSR分子標記具有高多態性和重復性,共顯性遺傳等優勢。研究所用的22對SSR分子標記是經過篩選獲得的多態性引物,具有較強的區分能力,在各品種中均表現出清晰的多態性帶型,可用于基因型分析并構建指紋圖譜。使用3個引物便可準確鑒別出26個棗品種,品種間遺傳相似系數在0.65～1.00。Li等[19]利用一組59個SSR標記對1 863個地方品種的遺傳多樣性和遺傳分化進行了分析。麻麗穎等[7]構建了36份棗種質的SSR指紋圖譜,為棗樹品種鑒定和分子育種提供了重要工具。張春梅等[20]利用5對SSR引物鑒定了黃河沿岸的50個不同酸棗樣品的遺傳相似性和群體結構,為酸棗種質資源保存和利用提供了依據。殷曉等[21]對陜北不同區域8個品種群的54份種質資源進行了SSR分子標記分析并研究了品種群間的遺傳關系,揭示了棗品種群分化及棗種質在起源地的親緣關系。

DNA指紋圖譜技術在植物種質鑒定方面具有重要的作用。研究通過毛細管電泳篩選出的22對核心引物對26份棗品種(系)進行了指紋圖譜的構建和UPGMA聚類分析。根據各品種的特征譜帶數據其中的3對特定引物(BFU0308,BFU1157和BFU0574)可將26個品種完全區分開,通過SSR DNA分子標記可以構建較理想的棗品種DNA指紋圖譜,在棗品種鑒定研究中具有重大意義。毛細管電泳畢其他電泳法相比具有成本低和減少排廢污染等優點[22]。但有一些SSR標記應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳來驗證,避免檢測出一些非目標PCR擴增產物。

4 結 論

共擴增出130條等位片段,平均5.909個。多態信息含量(PIC)變化范圍為0.237 7～0.855 6,平均為0.59。22對SSR引物的雜合度介于0.500～1.000,平均為0.927。3對引物BFU0308,BFU1157和BFU0574組合能完全區分26個棗品種。26個品種遺傳相似系數在0.65～1.00,相似系數0.65處可將26個品種分為兩大類群。