釀酒酵母啟動子的克隆及特性表征

孫琳琳,劉嘯塵,張宇飛,武占省,岳駿松

(西安工程大學 環境與化學工程學院/西安市紡織化工助劑重點實驗室,陜西 西安 710048)

0 引 言

合成生物學作為“未來改變世界的十大新興技術”,在生物醫藥、材料、環境、能源等領域發揮越來越重要的作用[1-2]。合成生物學解決這些領域重大問題的思路是通過改造或重新構建底盤細胞的代謝途徑賦予底盤細胞新功能,形成可持續的生物制造工藝[3-4]。如使用可再生原料開發化學品、燃料和營養保健品等高附加值物質[4-5]。然而,新引入的代謝途徑會影響底盤細胞的內源性代謝途徑的代謝流,這與確保細胞存活的需求相沖突。因此,如何平衡底盤細胞生長與新代謝途徑的代謝流是底盤細胞高效發揮功能的核心問題之一。釀酒酵母是食品工業中一類重要微生物[6],因其具有生長速度快、遺傳背景清晰、易于培養和安全性高的特性,被作為最常用的真核底盤細胞應用于合成生物學領域[7]。釀酒酵母被廣泛應用于生產高附加值生物化學物質中,如人參皂苷[8]、青蒿素[9]、白藜蘆醇[10-11]以及木糖[12]等。而啟動子作為合成生物學和代謝工程中控制和調控基因表達中至關重要的工具[13],不僅影響著外源基因的表達,還與本源基因的調控密切相關,研究啟動子對于基因的恰當表達以及遺傳構建體的快速表型化具有重要意義[14]。

高強度的啟動子并不意味著能夠產生更多的產物[15],這是由于這些基因的異常高轉錄會給宿主造成過多的代謝負荷,從而影響產物產量和品質[14,16]。更換不同啟動子[17]以及優化啟動子元件[18]為調節細胞內代謝途徑中關鍵基因表達水平提供了解決思路。李榮生等應用基因編輯技術將PERG20的啟動子替換為環氧鯊烯環合酶啟動子PERG1,研究啟動子對于單萜化合物生產的影響,調控表達強度后,以看成牛尨牛兒基焦磷酸(GPP)為前體的芳樟醇產量提高42.5%,以橙花基焦磷酸(NPP)為前體的橙花醇產量提高1 436.4%[19]。孫玲等通過更換啟動子構建釀酒酵母工程菌,以期獲得高產番茄紅素的目的菌株,調控表達強度后的番茄紅素產量提高8.09倍[20]。為了尋找效果最佳的啟動子,許多研究根據內源性啟動子在不同生長條件下的表達強度對其進行了表征或構建了啟動子庫,啟動子庫的構建對釀酒酵母基礎研究提供更多的參考和實用工具[21-23]。在檢測啟動子表達強度時,報告基因是最常用的輔助工具。LIANG等使用酵母增強的綠色熒光蛋白(yEGFP)作為報告基因,對釀酒酵母在壓力條件下和木糖存在下各種啟動子的活性進行了表征[24]。

因此本文基于這種思路,以釀酒酵母細胞INVSc1為宿主菌株,篩選得到6段啟動子序列,以pRS41H為出發質粒,利用綠色熒光蛋白基因表達,成功構建6個重組質粒。通過流式細胞儀對6株工程菌株的熒光表達強度測定,分析啟動子的表達EGFP強度,并探究啟動子隨著釀酒酵母生長過程中的活性以及強度變化,豐富和構建釀酒酵母啟動子文庫,為獲得高質量合成生物學啟動子元件提供參考價值。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

釀酒酵母S.cerevisiae INVSc1菌株作為啟動子克隆的模板。E.coli DH5α用于重組質粒的驗證和鑒定。質粒pRS41H為釀酒酵母表達載體,大小為5 388 bp。上述菌株和質粒保存于本實驗室。

1.1.2 實驗藥品

胰蛋白胨與酵母提取物(英國OXOID公司,試劑級別為GR);葡萄糖和氯化鈉(西隴化工有限公司,試劑級別為AR);甘油、無水乙醇、冰醋酸和Na2HPO4(北京化學試劑公司,試劑級別為AR);Tris飽和酚、D-山梨醇和EDTA(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);DNA Marker(根據實驗要求選自北京博邁德公司,貨號為BM 2000,由6條DNA條帶組成,分別為100 bp(50 ng/5 μL)、250 bp(50 ng/5 μL)、500 bp(50 ng/5 μL)、750 bp(75 ng/5 μL)、1 000 bp(50 ng/5 μL)和2 000 bp(100 ng/5 μL));實驗中用到的凝膠電泳DNA分子量對照均為BM 2000。Taq DNA聚合酶(生工生物工程(上海)有限公司);dNTP Mixture和rTaq DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司);限制性內切酶BamHI、EcoRI、Sal I(美國Fermentas公司);DNA提取試劑盒(上海碧云天生物技術)。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計與啟動子的克隆

過夜培養釀酒酵母,使用DNA提取試劑盒提取釀酒酵母基因組 DNA,于-20 ℃保存備用。從NCBI數據庫查詢釀酒酵母全基因組,分析數據并篩選啟動子。使用SnapGene軟件根據啟動子堿基序列設計引物。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,用于啟動子的克隆。啟動子篩選及引物設計如表1所示。

表 1 引物設計

表1中下劃線對應限制性內切酶EcoR I、BamH I、Sal I的酶切位點。以釀酒酵母基因組為模板進行PCR實驗以得到目的基因片段。將得到的啟動子片段通過凝膠回收的方法純化,用于后續載體的構建。

1.2.2 pRS41H-Promoter-EGFP載體的構建

將克隆得到的啟動子與增強綠色熒光蛋白EGFP基因通過OE-PCR的方法連接,構建Promoter-EGFP片段。含有EGFP的報告基因便于后續觀察啟動子的表達強弱。選用限制性內切酶BamH I/EcoR I與Sal I,將Promoter-EGFP片段與pRS41H質粒酶切后連接,從而得到pRS41H-Promoter-EGFP載體,質粒構建如圖1所示。

圖 1 重組質粒構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

1.2.3 pRS41H-Promoter-EGFP的導入與驗證

將pRS41H-Promoter-EGFP導入到大腸桿菌感受態細胞,涂布于Amp抗性的LB固體培養基上37 ℃培養過夜至長出單菌落。挑取單菌落,菌落PCR驗證其是否為陽性克隆,進一步將陽性克隆過夜培養,提取質粒,質粒PCR驗證是否含有目的基因片段。驗證通過后即可用于后續的釀酒酵母的轉化。

1.2.4 釀酒酵母的轉化

提取驗證后的pRS41H-Promoter-EGFP質粒,按照1∶10的比例將轉化樣品與感受態釀酒酵母細胞混合,轉入預冷的電擊杯中,冰浴5 min;轉化條件為電容25 μF,電壓1.5 kV,電阻200 Ω,電擊時間5 ms。電擊后立刻加入1 mL YPD 培養基,30 ℃孵育1 h,5 000 r/min 離心5 min,去上清。加入100 μL 1 mol/L的山梨醇重懸細胞,將其全部涂布于含有抗生素的YPD固體培養基上,30 ℃培養,觀察菌落的生長情況。

1.2.5 檢測熒光強度

挑取含有EGFP基因的釀酒酵母單菌落至YPD液體培養基中30 ℃,170 r/min條件下培養36 h,將2 mL菌液按比例1∶50接種于新鮮的YPD液體培養基中30 ℃,170 r/min培養,每12 h取樣1次。將樣品12 000 r/min離心2 min,棄上清,用PBS緩沖液重懸,再離心,棄上清,用 PBS 緩沖液將菌體稀釋OD600至0.6時,取1 mL稀釋后的樣品加入到流式小管中,使用流式細胞儀測定釀酒酵母細胞中EGFP的熒光強度。

2 結果與分析

2.1 啟動子與EGFP基因的克隆與純化

以提取出的釀酒酵母DNA為模板,使用Taq-DNA聚合酶對啟動子進行溫度梯度PCR實驗?？寺〕鰪腘CBI數據庫上篩選出的6個啟動子:PCBFI、PRTFI、PPOLI、PPOLII、PPOLII、PPAFI,啟動子長度與表1查找到的數據相符,得到的PCR產物如圖2(a)所示。其中A泳道為克隆得到的PCBFI,長度為515 bp;B泳道為克隆得到的PRTFI,長度為 348 bp;C泳道為克隆得到的PPOLI,長度為357 bp;D泳道為克隆得到的PPOLII,長度為371 bp;E泳道為克隆得到的PPOLIII,長度為290 bp;F泳道為克隆得到的PPAFI,長度為384 bp。對上述PCR產物進行凝膠純化,以去除雜帶DNA為后續實驗的干擾,相同字母泳道代表同種啟動子,純化后的PCR產物凝膠電泳圖譜如圖2(b)所示。用同樣的方法對EGFP基因序列進行PCR擴增,再將擴增得到的EGFP基因純化,純化后的凝膠電泳圖如圖2(c)所示,G泳道為凝膠純化得到的EGFP報告基因,長度為798 bp。凝膠電泳顯示所有目的基因均在對應的位置出現明顯DNA條帶,即證明得到目的基因。

2.2 啟動子與EGFP報告基因載體構建

通過報告基因來驗證啟動子的強弱是一種常用的方法,尤其是EGFP[25-26]。利用EGFP作為報告基因,具有檢測方便、無毒害、易于構建載體和活細胞定時定位觀察的優點。將純化后的EGFP報告基因通過OE-PCR技術與啟動子基因序列連接,得到Promoter-EGFP基因片段。選用BamH I/EcoR I與Sal I限制性內切酶,對凝膠純化后的高純度的Promoter-EGFP基因片段以及質粒pRS41H酶切,并使用T4連接酶連接切后的2個基因片段,將連接產物轉入感受態大腸桿菌后,進行菌落PCR驗證。大腸桿菌菌落PCR如圖3所示,其中圖3(a)～(f)分別為重組質粒:pRS41H-PCBFI-EGFP、 pRS41H-PPAFI-EGFP、pRS41H-PPOLI-EGFP、pRS41H-PPOLII-EGFP、pRS41H-PPOLIII-EGFP和pRS41H-PRTFI-EGFP的大腸桿菌菌落PCR凝膠電泳圖譜,篩選PCR反應中的陽性克隆,由圖3可知6株重組釀酒酵母中重組質粒均轉化成功。測序后,6組重組質粒均可用于后續釀酒酵母的轉化。

2.3 載體轉化及啟動子表征

將驗證過的pRS41H-Promoter-EGFP載體通過凝膠純化,使用電轉化法將上述連接得到的6個pRS41H-Promoter-EGFP載體轉入釀酒酵母后做菌落PCR確定目的基因已成功轉入。通過熒光顯微鏡觀察轉入后的釀酒酵母,鏡檢結果如圖4所示?？梢钥闯?6個重組酵母細胞均能觀察到明顯的熒光,這說明6株重組酵母菌株中的綠色熒光蛋白基因表達。

(a) pRS41H-PCBFI-EGFP (b) pRS41H-PPAFI-EGFP

為定量分析啟動子強度,使用流式細胞儀對釀酒酵母細胞中的熒光強度進行定量分析,測量結果如圖5所示。

圖 5 重組酵母熒光強度Fig.5 Fluorescence intensity of recombinant S.cerevisiae

可以看出,啟動子對報告基因的相對轉錄強弱依次為PPOLI>PPAFI>PPOLIII>PPOLII>PRTFI>PCBFI,且PPOLI相較于其他5個啟動子具有顯著性差異。根據啟動子相對轉錄強度的顯著性,可以將這6個啟動子劃分為不同強度類型的啟動子:PPOLI為強啟動子,PPAFI、PPOLIII、PPOLII為中等強度啟動子,PRTFI、PCBFI為弱啟動子。不同強度啟動子在調控代謝途徑,平衡代謝流中的均具有潛在應用價值。如,SHEN等通過使用不同表達強弱的啟動子優化了釀酒酵母甲羥戊酸途徑,以平衡甲羥戊酸途徑中頂部和底部基因的表達,進一步提高了番茄紅素的產量[27]。但是強啟動子可以通過提高其下游調控基因轉錄水平,進而調控下游基因高表達的能力,是上調代謝途徑中關鍵酶基因表達水平的重要調控元件[28]。所以,在代謝工程和合成生物學中對于要增加某一代謝途徑的代謝流時,強啟動子顯示出更重要的作用,具有更大的應用價值。這也表示PPOLI作為釀酒酵母中的調控元件,相較于其余啟動子具有更大的潛能。因此,研究啟動子轉錄強弱隨底盤細胞生長的變化具有十分重要的意義,選擇pRS41H-PPOLI-EGFP進行后續實驗。

2.4 PPOLI啟動子強度隨酵母細胞生長的變化

根據圖5,釀酒酵母啟動子PPOLI熒光強度最高,遂選取pRS41H-PPOLI-EGFP,研究熒光強度隨細胞生長的變化情況,每12 h測1次,持續180 h。圖6所示即為流式細胞儀測定的重組釀酒酵母的平均熒光強度隨細胞生長的變化。

圖 6 PPOLI重組釀酒酵母熒光強度檢測Fig.6 The fluorescence intensity of recombinant S.cerevisiae of PPOLI

從圖6可以看出,熒光強度隨著細胞的生長逐漸增強,最終維持在較高的轉錄水平。在12～24 h階段,熒光強度隨釀酒酵母生長增長速度最快,隨后生長速率放緩,與上一階段持平。釀酒酵母是合成生物學中最常用的真核底盤宿主細胞,啟動子作為合成生物學中的核心元件,在基因精準高效表達調控,代謝通路平衡方面發揮重要作用。WANG等利用強啟動子改造鏈霉菌底盤細胞,從而過量表達所需基因,提高工程鏈霉菌產物產量[29]。而啟動子PPOLI隨著釀酒酵母的生長,強度趨于某一水平并能持續表達,說明該啟動子可用于釀酒酵母底盤細胞中,作為釀酒酵母工廠產品質量和穩定產出的保障,從而在一定程度上可以為釀酒酵母工廠中啟動子的選擇和構建提供理論依據。

3 結 語

通過比對NCBI數據庫,成功篩選出釀酒酵母細胞中的6個啟動子,分別為:PCBFI、PPAFI、PPOLI、PPOLII、PPOLIII、PRTFI。利用OE-PCR和酶切構建pRS41H-Promoter-EGFP表達載體,并電擊轉入釀酒酵母細胞中。利用流式細胞術,測定各工程酵母的熒光表達強度,其中表達強度最高的為PPOLI,且明顯高于其他5個啟動子。此外,為了探究啟動子的表達強度隨酵母細胞生長的變化,以pRS41H-Promoter-EGFP工程酵母為研究對象,每隔12 h測其熒光表達強度,結果表明,啟動子隨著釀酒酵母的生長,表達強度也會隨之增強,并在180 h左右趨于穩定,維持在較高的轉錄水平。這些結果為構建釀酒酵母菌株在實際條件下進行高效生物生產提供了參考。