高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動(dòng)物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量

陳盛

摘 要：建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量的方法。樣品采用QuEChERS法凈化，以0.1%甲酸水溶液（含10 mmol乙酸銨）及乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，通過Poroshell 120 EC-C18液相色譜柱分離，以電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測模式對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析。該方法在2～200 μg·L-1線性良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.992，方法檢出限為0.01 mg·kg-1，定量限為

0.03 mg·kg-1。在加標(biāo)水平為0.03 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1時(shí)，方法的回收率為80.3%～94.3%，RSD在4.3%～8.7%。該方法操作簡便、檢測效率高，分離目標(biāo)物效果好，可以滿足動(dòng)物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量的檢測。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）；動(dòng)物性食品；氟吡菌胺；氟吡菌酰胺；螺蟲乙酯

High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for the Determination of Fluopicolide， Fluopyram and Spirotetramat Residues in Animal Food

CHEN Sheng

（Shanghai Bino Testing Service Co.， Ltd.， Shanghai 201114， China）

Abstract： Establish a method for the determination of residues of fluopicolide， fluopyram and spirotetramat in animal food by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. The sample was purified using the QuEChERS method， with 0.1% formic acid aqueous solution （containing 10 mmol ammonium acetate） and acetonitrile were used as mobile phases for gradient elution， separated by Poroshell 120 EC-C18 liquid-phase column， and the target substance was qualitatively and quantitatively analyzed by electrospray positive ion （ESI+） multi reaction monitoring mode. This method had good linearity in the linear range of 2～200 μg·L-1， and the correlation coefficients were＞0.992， the detection limit of the method is 0.01 mg·kg-1， and the quantitative limit is 0.03 mg·kg-1. At the spiking levels of 0.03 mg·kg-1，

0.10 mg·kg-1， and 0.30 mg·kg-1， the recovery rate of the method is 80.3% to 94.3%， and the RSD is 4.3% to 8.7%. This method is easy to operate， has high detection efficiency， and has good separation effect of the target substance， which can meet the detection of residues of fluopicolide， fluopyram， and spirotetramat in animal food.

Keywords： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; animal food; fluopicolide; fluopyram; spirotetramat

氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯均屬于廣譜類殺菌劑。氟吡菌胺，化學(xué)式為C14H8Cl3F3N2O，被廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物中卵菌門真菌引起的霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等重要病害的防控[1]。氟吡菌酰胺，化學(xué)式為C16H11ClF6N2O，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物中霜霉病、菌核病和葉斑病等病害的防控[2]。螺蟲乙酯化學(xué)式為C21H27NO5，可用于防治農(nóng)作物、果樹和蔬菜中的蚜蟲、木虱和蚧科等刺吸式口器害蟲[3]。該類型殺菌劑可通過污染土壤、水體等對(duì)畜禽養(yǎng)殖、人類生存環(huán)境及生命健康造成一定程度的影響。我國在最新實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）[4]中明確動(dòng)物性食品中這3種殺菌劑的最大殘留限量為

0.01 mg·kg-1。

目前，國內(nèi)關(guān)于農(nóng)產(chǎn)品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留的檢測方法主要為色譜法[5-6]、質(zhì)譜法[7-10]、QuEChERS-結(jié)合質(zhì)譜法[11-14]，尚無關(guān)于動(dòng)物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯同時(shí)使用QuEChERS-結(jié)合質(zhì)譜檢測的方法。本次研究擬以乙腈為提取液，采用QuEChERS法凈化樣品，用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量進(jìn)行測定，為日常開展相關(guān)檢測、標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，購自上海盒馬生鮮超市；牛肉，購自上海盒馬生鮮超市。

甲酸、乙酸銨、乙腈，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氯化鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100.10±0.03）μg·mL-1，北京振翔科技有限公司；氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

（1 000.5±3.0）μg·mL-1，北京振翔科技有限公司；螺蟲乙酯（101.20±0.05）μg·mL-1，阿爾塔科技有限公司；CNW SPE 基質(zhì)分散固相萃取純化管，150 mg MgSO4，50 mg PSA，2 mL/100 pcs，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：BP211D，德國Sartorius公司；高速冷凍離心機(jī)：Sovall ST16R，美國ThermoFisher公司；漩渦振蕩器：Basic Vortex Mixer，美國Talboys公司；氮吹儀：DC-24，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；高速均質(zhì)機(jī)：T18 digital ULTRA TURRAX，德國IKA公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1290+6470，美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取及凈化

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的肌肉組織樣品10 g（精確到0.01 g）放入50 mL離心管，加入20 mL乙腈溶液，加入3～5 g無水硫酸鈉于離心管中，使用高速均質(zhì)機(jī)對(duì)樣品均質(zhì)1 min，后將離心管置于渦旋振蕩器上繼續(xù)劇烈振蕩提取5 min，并離心10 min（4 ℃、

8 000 r·min-1）。移取乙腈層至另一離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷，于渦旋振蕩器上繼續(xù)劇烈振蕩后，以8 000 r·min-1速率離心5 min，棄去正己烷，乙腈層待凈化。

吸取10 mL乙腈轉(zhuǎn)移至SPE基質(zhì)分散固相萃取純化管中，渦旋混勻3 min，以8 000 r·min-1速率離心5 min。吸取上清液至試管中，在50 ℃條件下，氮吹吹至近干，用1∶1乙腈水溶液定容，過0.22 μm濾膜過濾，待上質(zhì)譜分析。

1.3.2 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液（含10 mmol乙酸銨）；流動(dòng)相B：乙腈。液相流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。流動(dòng)相流速0.3 mL·min-1；柱溫箱溫度40 ℃。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電噴霧正離子源（ESI+）；離子源溫度：150 ℃；電噴霧電壓：1.3 kV；毛細(xì)管電壓：4 kV；正離子掃描及多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：10 L·min-1；加熱氣流量：10 L·min-1；脫溶劑氣溫度：350 ℃；霧化氣壓力：40 psi。直接進(jìn)樣氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，獲得3種農(nóng)藥的母離子分別為m/z 383.0、397.1及374.1，后進(jìn)一步進(jìn)行離子掃描，分別得到定性離子及定量離子，通過質(zhì)譜條件優(yōu)化，得到最佳檢測靈敏度，最終結(jié)果具體數(shù)值詳見表2。

1.3.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別準(zhǔn)確稱取氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容，得到濃度為100 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液，保存于-18 ℃冰箱備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1 μg·mL-1）：分別用移液管準(zhǔn)確吸取0.50 mL氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。保存于4 ℃冰箱，有效期為7 d。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確稱取7份不含3種待測農(nóng)藥的空白實(shí)驗(yàn)樣品于50 mL離心管中，經(jīng)樣品前處理后，用得到的空白基質(zhì)溶液配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均分別為2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取甲醇和乙腈作為提取試劑，氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯均可溶于上述2種有機(jī)試劑。通過在空白基質(zhì)中添加氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，并使用這2種試劑進(jìn)行提取，考察其樣品回收率。結(jié)果顯示，乙腈提取回收率為95%，甲醇提取回收率為92%。這2種試劑均能達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求，實(shí)現(xiàn)3種農(nóng)藥的有效提取。其中，乙腈可以起到沉淀樣品中蛋白質(zhì)的作用，且從樣品中提取出的色素、脂肪較少，綜合考慮提取效果及回收率，選擇乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化方式的選擇

凈化是樣品前處理中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選取合適的凈化方式能夠有效去除基質(zhì)中的雜質(zhì)，縮短凈化時(shí)間，有效富集被測物，大大提高檢測靈敏度。在檢測動(dòng)物源性樣品中的農(nóng)藥殘留時(shí)，提取液中的脂肪、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)可能會(huì)給質(zhì)譜檢測結(jié)果帶來很大的基質(zhì)干擾，從而影響檢測結(jié)果的靈敏度及準(zhǔn)確度。

本次分別使用固相萃取法和QuEChERS法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)兩種方法均能滿足這3種農(nóng)藥的檢測需求，其中固相萃取法回收率為82%，QuEChERS法回收率為85%。但QuEChERS法具有節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間、消耗有機(jī)試劑少、操作簡單的優(yōu)勢，故選用QuEChERS法作為本實(shí)驗(yàn)的凈化方法。

2.3 線性關(guān)系與檢出限

稱取適量的氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度范圍在2～200 μg·L-1的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度（X，mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表3所示，相關(guān)系數(shù)均＞0.992，檢出限為0.01 mg·kg-1，定量限為0.03 mg·kg-1。

2.4 準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)法，選取豬肉、牛肉陰性樣品，分別添加0.03 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1及

0.50 mg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測定6次，測定后得到氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯在兩種不同肉類基質(zhì)中的平均回收率為80.3%～94.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.3%～8.7%。由表4可知，該方法的準(zhǔn)確度及精密度符合農(nóng)藥殘留分析檢測的要求。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了LC-MS/MS同時(shí)測定豬肉、牛肉基質(zhì)中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量的方法。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，采用QuEChERS法凈化，以0.1%甲酸水溶液（含10 mmol乙酸銨）及乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，通過Poroshell 120 EC-C18液相柱分離，以電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測模式對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析。該方法添加回收率在80.3%～94.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在4.3%～8.7%。實(shí)驗(yàn)證明該法在提高檢測效率、目標(biāo)物分離效果、精準(zhǔn)分析方面具有優(yōu)勢，完全可以滿足同時(shí)測定動(dòng)物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺蟲乙酯殘留量的需求。同時(shí)，也可為在魚、蝦、蟹、雞肉等類似基質(zhì)樣品中的方法研究提供參考依據(jù)。

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