食品檢驗(yàn)中微生物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

劉軻 張芬鵲 賀娜

摘 要：食品安全一直是公眾關(guān)注的焦點(diǎn)，微生物污染是引發(fā)食品安全問(wèn)題的重要因素之一。因此，食品檢驗(yàn)中微生物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。本文綜述了食品檢驗(yàn)中微生物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，期望為食品安全監(jiān)管機(jī)構(gòu)、食品生產(chǎn)者和相關(guān)研究人員提供參考，促進(jìn)食品檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和創(chuàng)新。

關(guān)鍵詞：食品檢驗(yàn)；微生物識(shí)別；檢測(cè)技術(shù)

Application of Microbiological Detection Technology in Food Inspection

LIU Ke1， ZHANG Fenque2， HE Na3

（1.Yanan Food Quality and Safety Inspection and Testing Center， Yanan 716000， China; 2.Weinan City Agricultural Product Quality and Safety Inspection and Testing Center， Weinan 714000， China; 3.Yanan City Institute for Drug Control， Yanan 716000， China）

Abstract： Food safety has always been the focus of public attention， and microbial contamination is one of the important factors triggering food safety problems. Therefore， the study of the application of microbial detection technology in food inspection has important theoretical and practical significance. This paper reviews the application of microbial detection technology in food inspection， expecting to provide references for food safety regulatory agencies， food producers and related researchers， and to promote the development and innovation of food inspection technology.

Keywords： food inspection; microbiological identification; detection technology

食品安全是公眾健康和社會(huì)穩(wěn)定的重要組成部分，而微生物污染是導(dǎo)致食品相關(guān)疾病和食品召回的主要原因之一[1]。因此，準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)食品中的微生物污染至關(guān)重要。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，食品檢驗(yàn)中的微生物檢測(cè)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。食品中的微生物污染包括食源性病原菌、腐敗菌、病毒和寄生蟲(chóng)等，它們可能導(dǎo)致食用者產(chǎn)生食物中毒、食源性感染和其他健康問(wèn)題[2-3]。為了保障公眾的食品安全，食品行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)不斷探索和引入新的微生物檢測(cè)技術(shù)，以便及早發(fā)現(xiàn)和控制潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。本論文旨在對(duì)食品檢驗(yàn)中微生物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行深入研究，關(guān)注各種微生物檢測(cè)方法的原理、流程和優(yōu)勢(shì)，并探討它們?cè)谑称窓z驗(yàn)中的具體應(yīng)用。通過(guò)深入了解微生物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，為食品行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供有價(jià)值的指導(dǎo)和決策支持，以確保食品的質(zhì)量和安全，保護(hù)公眾的健康。

1 食品安全與微生物污染的關(guān)系

微生物污染與食品安全密切相關(guān)，食品中存在的微生物可以引發(fā)食物中毒和傳染疾病。因此，對(duì)食品中的微生物進(jìn)行檢測(cè)和控制非常重要。食品生產(chǎn)和加工過(guò)程中的衛(wèi)生管理、適當(dāng)?shù)募訜岷蛢?chǔ)存條件以及微生物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用都是確保食品安全的關(guān)鍵因素。以下是威脅食品安全的幾種微生物污染因素。

（1）食源性病原菌。食品中可能存在的病原菌包括沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌等，它們主要通過(guò)糞便污染食品或經(jīng)不潔的加工環(huán)境進(jìn)入食物中，攝入食品中的病原菌可導(dǎo)致胃腸道疾病，引起腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀。

（2）腐敗菌和變質(zhì)標(biāo)志物。食品腐敗常由細(xì)菌引起，如產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗酵母，它們會(huì)分解食品中的營(yíng)養(yǎng)成分，產(chǎn)生惡臭氣味，并產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物。這些細(xì)菌和代謝產(chǎn)物可能會(huì)導(dǎo)致食品變質(zhì)，降低食品的質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

（3）致病病毒和寄生蟲(chóng)。除了細(xì)菌外，食品中也可能存在病毒和寄生蟲(chóng)，如諾如病毒、肝炎病毒和鉤蟲(chóng)。這些病原體可以通過(guò)未經(jīng)充分加熱處理的食品（如生肉、生蔬菜）傳播，攝入被感染的食物后，人體可能出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、黃疸等癥狀。

（4）毒素產(chǎn)生菌。一些細(xì)菌可以在食品中產(chǎn)生毒素，如產(chǎn)生肉毒桿菌毒素的肉毒桿菌。這些毒素通常無(wú)法通過(guò)加熱殺滅，因此即使食物在烹飪過(guò)程中細(xì)菌被殺死，毒素仍可能存在，食用后可能導(dǎo)致嚴(yán)重的中毒癥狀。

2 微生物檢測(cè)技術(shù)方法及流程

2.1 微生物檢測(cè)技術(shù)方法

2.1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是最常用的微生物檢測(cè)技術(shù)之一。該技術(shù)需要將食品樣品在特定培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，并利用細(xì)菌、真菌和酵母等微生物的生長(zhǎng)特性對(duì)樣本進(jìn)行鑒定[4]。這種方法需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間（通常需要24～48 h或更長(zhǎng)時(shí)間），但具有較高的特異性和可靠性。

2.1.2 分子生物學(xué)方法

分子生物學(xué)方法利用微生物的DNA或RNA來(lái)進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是最常用的技術(shù)之一，它可以通過(guò)擴(kuò)增微生物的基因片段快速檢測(cè)和定量微生物[5]。實(shí)時(shí)定量PCR是一種改進(jìn)的PCR技術(shù)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)，從而提供更精確的結(jié)果。循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增的方法，具有較高的特異性和較快的檢測(cè)速度。

2.1.3 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法利用抗體與微生物的抗原結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種常用的免疫學(xué)方法，可以通過(guò)測(cè)量免疫反應(yīng)生成的信號(hào)來(lái)檢測(cè)微生物。另外，免疫層析試紙法是一種簡(jiǎn)便快速的免疫學(xué)方法，通常用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.1.4 快速檢測(cè)技術(shù)

快速檢測(cè)技術(shù)結(jié)合了多種方法，旨在更快地提供檢測(cè)結(jié)果。其中，基于生物傳感器的檢測(cè)方法利用生物材料（如細(xì)胞、酶）與目標(biāo)微生物的特定反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生電信號(hào)或光信號(hào)，并通過(guò)傳感器檢測(cè)確定目標(biāo)微生物的數(shù)量。基于納米材料的檢測(cè)方法利用納米顆粒的特殊性質(zhì)，如表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface Enhancement of Raman Scattering，SERS）或熒光增強(qiáng)效應(yīng)，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)微生物的快速檢測(cè)。

2.2 微生物檢測(cè)流程

（1）進(jìn)行樣品采集，從目標(biāo)食品中采集代表性樣品，確保采集樣品時(shí)遵循衛(wèi)生規(guī)范，以防止交叉污染。

（2）對(duì)采集的食品樣品進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)行樣品的稀釋、浸泡、離心等，以去除可能存在的干擾物質(zhì)，如殘留農(nóng)藥、抑制物質(zhì)等。

（3）對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)處理，以增加微生物的數(shù)量，根據(jù)微生物的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)特征，使用適當(dāng)?shù)蔫b定方法來(lái)確定微生物的種類(lèi)。如果需要更精確的檢測(cè)結(jié)果，可以使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物檢測(cè)，包括DNA或RNA提取、PCR擴(kuò)增、實(shí)時(shí)定量PCR等，也可以利用抗體與微生物的抗原結(jié)合來(lái)進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫層析試紙法等。

（4）根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及解讀，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)確定微生物數(shù)量是否符合安全要求。

（5）生成詳細(xì)的檢測(cè)報(bào)告，包括樣品信息、檢測(cè)方法、檢測(cè)結(jié)果和解讀以及可能的建議措施。

3 食品檢驗(yàn)中微生物檢測(cè)技術(shù)的具體應(yīng)用

3.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食源性病原菌

實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）檢測(cè)食源性病原菌具有高度敏感性、快速性、特異性、定量能力、自動(dòng)化和高通量性、可靠性和重復(fù)性等優(yōu)勢(shì)。它能夠提供早期警示、多重檢測(cè)和檢測(cè)非活躍狀態(tài)的微生物，適用于各種食品樣品檢測(cè)，這使得qPCR成為食品檢驗(yàn)中微生物檢測(cè)的重要工具，有助于確保食品安全，保護(hù)公共健康。

在實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食源性病原菌的過(guò)程中，首先根據(jù)檢測(cè)目的和特定要求，選擇要檢測(cè)的食源性病原菌。例如，選擇沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157：H7或單核細(xì)胞增生李斯特菌等。從食品樣品中采集代表性樣品，并進(jìn)行必要的預(yù)處理，包括樣品的稀釋、攪拌、研磨或其他樣品制備方法，以獲得合適的樣品溶液用于后續(xù)的DNA提取。使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒或其他適用的提取方法，從樣品中提取目標(biāo)病原菌的DNA，對(duì)于RNA病原菌如諾如病毒，則需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，以便進(jìn)行后續(xù)的PCR分析。

準(zhǔn)備qPCR反應(yīng)體系，包括引物（特異性序列）和探針（通常帶有熒光標(biāo)記），用于擴(kuò)增和檢測(cè)目標(biāo)病原菌的特定基因片段。確保控制組包括正控樣品（含有目標(biāo)病原菌DNA的樣品）和負(fù)控樣品（不含目標(biāo)病原菌DNA的樣品）。在qPCR儀器中運(yùn)行反應(yīng)，并監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的增加情況，該信號(hào)與擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段的數(shù)量成正比，通過(guò)相對(duì)定量或絕對(duì)定量方法，最終確定樣品中目標(biāo)病原菌的數(shù)量。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或已知濃度的參考樣品，將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為目標(biāo)病原菌的數(shù)量；根據(jù)設(shè)定的閾值，判斷樣品為陽(yáng)性或陰性，并計(jì)算病原菌的濃度。生成詳細(xì)的監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)告，其中包括樣品信息、檢測(cè)方法、檢測(cè)結(jié)果、病原菌的濃度等。如果檢測(cè)結(jié)果表明食品中存在食源性病原菌的污染，應(yīng)通過(guò)追溯措施來(lái)確定污染源，并采取適當(dāng)?shù)目刂拼胧源_保食品的安全性和質(zhì)量。

3.2 GC-MS技術(shù)檢測(cè)食品中的腐敗菌和變質(zhì)標(biāo)志物

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）技術(shù)是一種聯(lián)用技術(shù)，將氣相色譜（GC）和質(zhì)譜（MS）兩種分析技術(shù)結(jié)合在一起，用于分離、鑒定和定量分析復(fù)雜混合物中的化合物。GC-MS技術(shù)在食品中腐敗菌和變質(zhì)標(biāo)志物的檢測(cè)中具有高靈敏度、高選擇性、定性定量分析的優(yōu)勢(shì)，能夠適應(yīng)不同類(lèi)型的食品樣品檢測(cè)，提供快速分析結(jié)果，為食品安全和質(zhì)量控制提供了可靠的工具。

使用GC-MS技術(shù)檢測(cè)食品中的腐敗菌和變質(zhì)標(biāo)志物時(shí)，首先需要收集食品樣品，如肉類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、奶制品等，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚ㄇ懈睢⒀心セ蛉芙獾龋员闾崛∧繕?biāo)化合物。使用溶劑提取、脂肪提取或固相微萃取等技術(shù)，將目標(biāo)化合物從食品樣品中提取出來(lái)；將提取得到的樣液注入GC系統(tǒng)中，GC利用樣品中化合物的揮發(fā)性差異將化合物分離出來(lái)。常用的氣相色譜柱包括非極性柱、極性柱或選擇性柱，根據(jù)目標(biāo)化合物的特性進(jìn)行選擇。通過(guò)與GC聯(lián)用的質(zhì)譜儀，對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。將分離的化合物逐個(gè)引入質(zhì)譜儀，分析化合物的質(zhì)譜圖譜，每種化合物都具有獨(dú)特的質(zhì)譜圖譜，可與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)譜進(jìn)行比對(duì)，以鑒定化合物的類(lèi)別。根據(jù)GC-MS的結(jié)果，分析和解釋樣品中存在的化合物，通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)中的譜圖確定化合物的身份和含量。

在監(jiān)測(cè)食品中的腐敗菌和變質(zhì)標(biāo)志物時(shí)，GC-MS技術(shù)可以檢測(cè)和鑒定多種揮發(fā)性有機(jī)化合物（Volatile Organic Compounds，VOCs），如醛類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)和硫化合物等。這些化合物通常與食品的腐敗和變質(zhì)過(guò)程密切相關(guān)，通過(guò)分析這些化合物的質(zhì)譜圖譜可以大致確定食品樣品的腐敗程度和變質(zhì)狀態(tài)。

3.3 PCR/RT-PCR技術(shù)檢測(cè)食品中的病毒和寄生蟲(chóng)

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是兩種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測(cè)和擴(kuò)增DNA或RNA序列。它們?cè)谑称窓z測(cè)中被廣泛應(yīng)用，具有高度敏感性、特異性和定量能力，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和定量食品中的致病微生物或病原體。這些優(yōu)勢(shì)使得PCR/RT-PCR成為食品安全監(jiān)測(cè)和控制中不可或缺的工具。

通過(guò)PCR/RT-PCR方法檢測(cè)食品中的病毒和寄生蟲(chóng)時(shí)，要從食品樣品中提取病毒核酸，并進(jìn)行樣品處理。對(duì)食品樣品進(jìn)行攪拌、離心和過(guò)濾等加工和處理，去除固體顆粒和雜質(zhì)，并提取病毒核酸。使用商業(yè)化的RNA/DNA提取試劑盒，按照廠家提供的指南進(jìn)行操作，提取食品樣品中的病毒RNA或DNA，用于后續(xù)的PCR/RT-PCR分析，提取步驟通常包括細(xì)胞破碎、核酸結(jié)合、洗滌和洗脫等。如果目標(biāo)病毒是RNA病毒，需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT）步驟將RNA轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶（RT酶）和適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用適當(dāng)?shù)囊锖蚉CR/RT-PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行病毒核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。引物的選擇應(yīng)基于目標(biāo)病毒的特定序列，反應(yīng)體系包括DNA/RNA模板、引物、酶（如聚合酶）、緩沖液和核酸擴(kuò)增所需的核苷酸。

為了增加PCR/RT-PCR檢測(cè)的靈敏度，應(yīng)采用前處理步驟，包括預(yù)擴(kuò)增或使用嵌合引物，以增加目標(biāo)基因的拷貝數(shù)或縮小擴(kuò)增目標(biāo)的大小。擴(kuò)增反應(yīng)完成后通過(guò)凝膠電泳或其他檢測(cè)方法分析PCR/RT-PCR產(chǎn)物，凝膠電泳可用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和質(zhì)量。此外，可以使用DNA探針或比色劑等方法進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)果的特異性確認(rèn)。通過(guò)與已知的陽(yáng)性對(duì)照樣品進(jìn)行比較，確認(rèn)食品樣品中是否存在目標(biāo)病毒；使用定量PCR/RT-PCR方法來(lái)確定目標(biāo)病毒的數(shù)量，從而評(píng)估食品樣品中的病毒負(fù)載水平。

在PCR/RT-PCR檢測(cè)中，質(zhì)量控制至關(guān)重要，包括使用對(duì)照樣品進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證試劑是否無(wú)污染，同時(shí)評(píng)估檢測(cè)過(guò)程中的假陽(yáng)性結(jié)果。需要注意的是，不同病毒的檢測(cè)方法可能會(huì)有所不同，因此在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)目標(biāo)病毒的特性和檢測(cè)要求進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化及調(diào)整。此外，PCR/RT-PCR方法需要特定的設(shè)備和實(shí)驗(yàn)條件，并且對(duì)操作者的技術(shù)要求較高，需要在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行。

4 結(jié)語(yǔ)

食品檢驗(yàn)中微生物檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用研究對(duì)于確保食品安全至關(guān)重要。本文綜述了不同微生物檢測(cè)技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食源性病原菌、GC-MS技術(shù)檢測(cè)食品中的腐敗菌和變質(zhì)標(biāo)志物以及PCR/RT-PCR技術(shù)檢測(cè)食品中病毒和寄生蟲(chóng)的原理、流程和優(yōu)勢(shì)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，微生物檢測(cè)技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用將更加準(zhǔn)確、快速和便捷。未來(lái)，期待更多新技術(shù)出現(xiàn)，以滿(mǎn)足食品安全監(jiān)管的需求。

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