6起副溶血性弧菌食源性疾病聚集事件分離株病原學特征分析

李東迅 舒高林 王維鈞 張陽 谷田 牛桓彩

摘 要：目的：分析北京市昌平區2018—2019年6起副溶血性弧菌食源性疾病聚集事件分離株的血清型、耐藥性、毒力基因和分子特征。方法：對6起事件中的23株副溶血性弧菌進行血清學分型、毒力基因檢測、微量肉湯稀釋藥敏實驗和脈沖場凝膠電泳。結果：21株人源分離株鑒定為3種血清型（O3：K6、O4：K8和O4：KUT），主要為O3：K6型，毒力基因均為tlh+、tdh+、trh-；2株食品分離株血清型為O8：K20，毒力基因為tlh+、tdh-、trh-。藥敏結果顯示，對頭孢唑啉12株菌敏感，5株耐藥，6株中介；對氨芐西林1株菌中介，其余菌株敏感；對其他15種抗生素23株菌均敏感。PFGE聚類分析顯示，23株副溶血性弧菌分為8種PFGE帶型，5起事件的人源分離株屬于優勢PFGE帶型PT06。結論：6起事件中的副溶血性弧菌血清型主要為O3：K6，多數菌株屬于優勢帶型PT06，無多重耐藥菌出現，人源分離株均攜帶毒力基因tlh和tdh。

關鍵詞：副溶血性弧菌；血清型；脈沖場凝膠電泳；耐藥性；毒力基因

Traceability Analysis of 6 Vibrio parahaemolyticus Food Poisoning Incidents

LI Dongxun， SHU Gaolin， WANG Weijun， ZHANG Yang， GU Tian， NIU Huancai*

（Changping District Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102206， China）

Abstract： Objective： To analyze the serotype， drug resistance， virulence genes and PFGE characteristics of strains isolated from 6 Vibrio parahaemolyticus food poisoning incidents in Changping district of Beijing in 2018—2019. Method： Serotyping， virulent genes detection， broth microdilution method and pulsed field gel electrophoresis （PFGE） typing tests were performed on 23 Vibrio parahaemolyticus strains in 6 incidents. Result： The 21 human isolated strains were identified as three serotypes （O3：K6， O4：K8， and O4：KUT）， O3：K6 was the dominant serotype， and the virulence genes were tlh+， tdh+， trh-. The 2 strains collected from food samples were O8：K20， and the virulence genes were tlh+， tdh-， trh-. 12 strains are sensitive to cefazolin， 5 strains are resistant， and 6 strains are intermediate. There was 1 strain showed intermediate to ampicillin， while all strains were sensitive to the other 15 antibiotics. The 23 strains of Vibrio parahaemolyticus were analyzed by PFGE clustering to obtain 8 PFGE patterns， the pandemic pattern PT06 was found in 5 incidents. Conclusion： The dominant serotypes of Vibrio parahaemolyticus strains isolated from 6 incidents were O3：K6 and the predominant PFGE patterns was PT06. There were no multi-antibiotic resistance. All human isolated strains had the virulence gene tlh and tdh.

Keywords： Vibrio parahaemolyticus; serotypes; pulsed field gel electrophoresis; drug resistance;

virulence genes

副溶血性弧菌主要存在于海產品、鹽漬食品中，感染后會引起腹瀉、嘔吐、發燒、血便等急性胃腸炎癥狀，是引起水產類食物中毒的主要病原菌[1-3]。近年來，海產品消費大眾化，內陸地區由副溶血性弧菌引起的食物中毒呈上升趨勢[3-4]。北京市昌平區近年的腹瀉病原菌監測結果顯示，副溶血性弧菌腹瀉病例也呈上升趨勢[5]。本研究對2018—2019年北京市昌平區發生的6起食源性疾病聚集事件中分離到的23株副溶血性弧菌，進行脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，FPGE）、耐藥和毒力基因檢測，分析菌株PFGE型別、耐藥性及毒力基因攜帶情況，為本地區副溶血性弧菌食源性疾病的預防和控制提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

2018—2019年北京市昌平區6起食源性疾病聚集事件中分離到的23株副溶血性弧菌（事件1：5株；事件2：1株；事件3：3株；事件4：9株；事件5：2株；事件6：3株），其中20株來源于患者，1株（事件4）來源于廚師（帶菌者），2株（事件4）來源于食品。藥敏質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922。

1.2 試劑及儀器

副溶血性弧菌分型血清（日本生研）；革蘭陰性需氧菌藥敏檢測A3板和A4板（上海星佰）；副溶血性弧菌tlh/tdh/trh三重實時熒光PCR檢測試劑盒（北京卓誠惠生）；Seakem Gold 瓊脂糖（瑞士LONZA）；限制性內切酶Xba I、Sfi I（美國NEB）；蛋白酶K

（德國Merck）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche LightCycler 480）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad）；脈沖場凝膠電泳（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 血清分型

血清分型嚴格按照副溶血性弧菌血清抗體產品說明書對菌株進行，K抗原不可分型計為KUT。

1.3.2 毒力基因

采用水煮法進行基因組DNA提取：挑取適量新鮮培養的菌苔于200 μL無菌水中，渦輪振蕩混勻，100 ℃金屬浴10 min，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液待用。耐熱直接溶血毒素基因（tdh）、耐熱相關溶血毒素基因（trh）和不耐熱溶血毒素基因（tlh）3種毒力基因的檢測方法詳見試劑盒說明書。

1.3.3 藥敏實驗

選用17種抗生素進行藥敏實驗，即氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、復方磺胺甲惡唑、四環素、氯霉素、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢吡肟、慶大霉素、亞胺培南、阿米卡星、美羅培南、環丙沙星和左氧氟沙星，17種抗生素相應的濃度詳見說明書。藥敏實驗操作和結果判讀嚴格按照說明書進行。質控菌株腸埃希氏菌ATCC25922。

1.3.4 PFGE分型

參照國家致病菌識別網的副溶血性弧菌的脈沖場凝膠電泳標準[6]，選用限制性內切酶SfiⅠ對副溶血性弧菌進行酶切，沙門菌標準株H9812選用限制性內切酶Xba I進行酶切。用BioNumerics軟件對PFGE圖譜進行處理分析，采用算術平均值加權配對組合法構建聚類樹狀圖。按照Tenover原則判斷菌株間關系，即酶切后圖譜完全一致定為同一菌株型；圖譜有條帶不同者1～3條，可認為菌株間關系較密切；圖譜有3條以上條帶不同者認為菌株間關系不密切[6]。

2 結果與分析

2.1 血清分型

6起事件中有5起的副溶血性弧菌血清型為O3：K6型，事件3為O4：K8型，事件4為O3：K6、O8：K20型兩種血清型，事件1為O3：K6、O4：K8、O4：KUT 3種血清型（表1）。

2.2 毒力基因檢測

6起事件中的21株人源分離株毒力基因均為tlh+、tdh+、trh-，2株食品分離株毒力基因為tlh+、tdh-、trh-（表1）。

2.3 藥敏結果

6起事件中的副溶血性弧菌對氨芐西林，除事件1中有1株菌（4.35%）中介外，其他菌株均敏感；對頭孢唑林，事件1的5株菌（21.74%）全部耐藥，6株菌（事件5、事件6中各2株，事件2、事件4中各

1株；26.09%）中介，其余菌株敏感；6起事件中的副溶血性弧菌對其他15種抗生素完全敏感，實驗中未出現多重耐藥菌株（表2）。

2.4 PFGE分型

由圖1可知，事件1的5株菌分為4種PFGE帶型，即PT01～PT04；事件2、事件3、事件5和事件6的菌株只有1種PFGE帶型；事件4的人源分離株均為PT06，食品分離株均為PT08。圖中監測來源屬于散發病例，發現帶型PT02、PT03、PT06和PT09在散發病例菌株中也有出現，PT01、PT04分別與散發病例菌株PFGE帶型PT10、PT05相差1個條帶，PT07與散發病例菌株帶型PT03相差2個條帶。

3 結論與討論

食用被副溶血性弧菌污染的食物可引起副溶血性弧菌食物中毒，主要為海產品，多發生在沿海地區，夏秋季（6—10月）居多，具有明顯的高溫季節高發特征[7]。在食源性疾病的主動監測中，北京地區由副溶血性弧菌引發食源性疾病事件逐年上升，以O3：K6型和O4：K8型最常見，食物中毒事件中又以O3：K6為主[4-5，8-9]。本研究中有5起事件的副溶血性弧菌血清型為O3：K6型（13株菌）。本研究還出現2株食品分離株為O8：K20型，該血清型比較少見，應引起關注。

急性胃腸道癥狀主要由不耐熱溶血毒素（Thermolabile Hemomysin，TLH）、耐熱直接溶血毒素（Thermotolerant Direct Hemolysin，TDH）和耐熱相關溶血毒素（Thyrotropin-Releasing Hormone，TRH）引起，基因編碼分別為tlh、tdh、trh。毒力基因tdh和trh是副溶血性弧菌最主要的毒力基因，tlh基因則有種屬特異性[10-11]。以往研究結果顯示[10]，臨床分離株大多含有tdh基因，含trh基因菌株較少；食品分離株或環境分離株大多不含tdh和trh基因。本研究中，6起事件中的人源（病例和廚師）分離株毒力基因均為tlh+、tdh+、trh-，而食品分離株毒力基因為tlh+、tdh-、trh-。

近年來，隨著物流、快遞行業的迅速發展，海產品在內陸地區銷量增加，進一步推動了海產品的大量養殖，副溶血性弧菌污染也成為海產品養殖業的主要威脅之一。同時，抗生素的不規范使用使得副溶血性弧菌耐藥性日益嚴重。有研究顯示，北京市副溶血性弧菌人源分離株對頭孢唑啉、鏈霉素和氨芐西林的耐藥性較高[11]。本研究中的副溶血性弧菌除頭孢唑啉外，對其他抗生素都比較敏感，與本區散發病例分離株耐藥性一致[5，12]。雖然本研究的副溶血性弧菌對多數抗生素敏感且無多重耐藥菌株出現，也應引起重視，臨床治療過程中應合理用藥，減少耐藥副溶血性弧菌的產生[11]。

PFGE常用于病原菌的分子流行病學研究，可以從分子層面分析菌株關系，對菌株進行溯源分析[6]。本研究中，6起事件中菌株的PFGE帶型與本地區散發病例株帶型相同或相差1～2個條帶，有3起事件由食源性疾病主動監測中的優勢帶型（PT06）引起。根據Tenover判定原則，帶型相差1或2個條帶的菌株來源于同一克隆源，由此可推測另3起事件菌株與本地區散發病例菌株親緣關系密切。事件4的廚師分離株與病例株帶型相同，推測此次事件可能由帶菌廚師傳染引起，應加強廚師等食品從業人員的專業培訓，對其進行食品安全知識的宣傳教育，提高此類從業人員的食品安全意識。相應監管部門應加強餐館等食品行業的監督，減少食源性疾病事件的發生。除事件4外，其余5起事件無法溯源，需要進一步提高流調人員的流行病學調查能力和實驗室的檢測水平，進而提高問題食品的溯源能力。

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