凱氏定氮法測定花生中蛋白質方法的優化

杜蒙 孫允超 李雯雯 王曉軍 賈瑞杰 程倩倩

摘 要：對凱式定氮法測定花生蛋白質含量的方法進行研究，以花生為試驗材料，研究不同消解溫度、消解時間、濃硫酸用量對花生蛋白質含量的影響，從而確定優化后的試驗條件。結果顯示，當濃硫酸的用量為10 mL，消解溫度為420 ℃，消解時間為1.5 h時，回收試驗和重復性試驗等結果較好。優化后的方法降低了濃硫酸的用量，對于蛋白質含量較高的花生樣品可消解完全，為高效、準確測定花生蛋白質的含量提供了參考。

關鍵詞：凱式定氮法；花生蛋白質；單因素試驗

Optimization of Kjeldahl Method for Determination of Protein Methods in Peanuts

DU Meng， SUN Yunchao， LI Wenwen， WANG Xiaojun， JIA Ruijie， CHENG Qianqian*

（Liaocheng Academy of Agricultural Sciences， Liaocheng 252000， China）

Abstract： A study was conducted on the method of determining peanut protein content using the Kjeldahl nitrogen method. Peanuts were used as experimental materials to investigate the effects of different digestion temperatures， digestion times， and amounts of concentrated sulfuric acid on peanut protein content. The optimized experimental conditions were determined. The results showed that when the amount of concentrated sulfuric acid was 10 mL， the digestion temperature was 420 ℃， and the digestion time was 1.5 hours， the recovery test and repeatability test results were good. The optimized method reduces the amount of concentrated sulfuric acid and achieves complete digestion of peanut samples with high protein content， providing a reference for efficient and accurate determination of peanut protein content.

Keywords： Kjeldahl nitrogen method; peanut protein; single-factor experiment

花生中蛋白質含量較為豐富，每百克含量大約為22 g。花生是我國可食用的優質植物蛋白，極易被人體吸收。目前，測定花生中蛋白質含量的方法有很多，凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，具有操作簡單、測定結果準確、成本低廉[1-2]等優勢，目前依然被廣泛使用。

凱氏定氮法的測定原理是花生中的蛋白質在催化加熱消化條件下分解，產生的氨與硫酸生成硫酸銨。加入氫氧化鈉堿化蒸餾后使氨游離，用硼酸混合指示劑吸收后，以硫酸或鹽酸標準滴定溶液進行滴定，根據滴定量計算氮的含量，再乘以相關食品的換算系數，即為蛋白質的含量。本文主要對《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016）第一法—凱氏定氮法測定花生蛋白質含量時的操作步驟進行單因素試驗，探討各因素對花生蛋白質含量測定值的影響，優化花生蛋白質測定的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生樣品（茌平基地采摘）；五水硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、硼酸、硫酸銨甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇，國藥集團；濃硫酸（98%）、濃鹽酸，天津市科密歐化學試劑有限公司。除硫酸銨試劑為優級純外，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

全自動凱氏定氮儀（濟南海能）；石墨消解儀（濟南海能）；電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特）；分析天平（中國梅特勒托利多）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

硼酸溶液（20 g·L-1）：稱取硼酸試劑20 g溶解于蒸餾水中后稀釋至1 000 mL。

氫氧化鈉溶液（400 g·L-1）：稱取氫氧化鈉試劑400 g溶于蒸餾水中，冷卻至室溫，稀釋至1 L。

0.1 mol·L-1的鹽酸標準滴定溶液：準確量取

8.3 mL濃鹽酸于容量瓶中，用蒸餾水定容至1 L，用無水碳酸鈉標定。用萬分之一天平稱取經105 ℃烘

3 h冷卻后的無水碳酸鈉0.2 g（精確至0.000 1 g），溶于100 mL水中，并加入20 mL硼酸混合指示劑，用鹽酸滴定，同時做空白，滴定后煮沸，變色后繼續滴定（約2～4滴），此滴定量為最終滴定結果，計算公式為

（1）

式中：C為鹽酸標準溶液的濃度，mol·L-1；m為稱量無水碳酸鈉基準試劑的質量，g；V為滴定時消耗鹽酸標準溶液的體積，mL；105.99為無水碳酸鈉的摩爾質量。

甲基紅乙醇溶液（1 g·L-1）：稱取甲基紅試劑

0.1 g，用95%乙醇稀釋至100 mL。

溴甲酚綠乙醇溶液（1 g·L-1）：稱取溴甲酚綠試劑0.1 g，用95%乙醇稀釋至100 mL。

混合指示劑：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。取4 mL甲基紅乙醇溶液和20 mL溴甲酚綠乙醇溶液混合，取混合液20 mL加在2 L硼酸溶液中。

1.3.2 樣品處理

稱取打碎混勻的花生樣品0.3 g（精確至0.000 1 g）至250 mL消解管中，每個消解管中加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及10 mL硫酸于石墨消解儀進行消解，消解完畢后，消解管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻，每批次需做空白試樣，于全自動凱氏定氮儀上測定。

堿管路試劑桶中裝氫氧化鈉溶液（400 g·L-1），酸管路試劑桶中裝硼酸混合指示劑溶液（20 g·L-1），水管路試劑桶中裝蒸餾水，滴定酸試劑瓶中裝鹽酸標準滴定溶液0.1 mol·L-1，儀器設定加堿量為40 mL，加水量20 mL，硼酸混合指示液20 mL，蒸餾時間

5 min。蒸餾結束后，儀器使用鹽酸標準滴定溶液

0.1 mol·L-1進行自動滴定，記錄滴定鹽酸用量。

1.3.3 單因素試驗

（1）消解溫度。稱取樣品并加入催化劑和10 mL濃硫酸后，當消解溫度分別達到360 ℃、380 ℃、400 ℃、420 ℃、440 ℃、460 ℃后，再繼續消解1.5 h，消解完畢后，于全自動凱氏定氮儀上測定。

（2）濃硫酸用量。稱取樣品并加入催化劑后，分別加入5 mL、8 mL、10 mL、12 mL、15 mL濃硫酸，在消解溫度為420 ℃、消解時間為1.5 h的條件下，消解完畢后，于全自動凱氏定氮儀上測定。

（3）消解時間。稱取樣品并加入催化劑和10 mL濃硫酸后，當消解溫度達到420 ℃后，繼續消解

0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，消解完畢后，于全自動凱氏定氮儀上測定。

1.3.4 空白試驗

空白試驗，除不稱取花生樣品，稱取0.5 g蔗糖外，其余測定步驟同樣品測定步驟。

1.3.5 回收試驗

準確稱取優級純硫酸銨基準試劑0.2 g（精確至0.000 1 g）于消解管中，無需消解，于全自動凱氏定氮儀上測定。

1.3.6 重復性試驗

準確稱取7份0.3 g（精確至0.000 1 g）的花生樣品，用本文優化后的條件方法分別進行試驗。

1.3.7 花生中蛋白質含量的計算

計算公式為

（2）

式中：X為試樣中蛋白質的含量，g/100 g；V1為試液中消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；V2為空白樣品中消耗鹽酸標準滴定液的體積，mL；C為鹽酸標準滴定溶液濃度，mol·L-1；0.014為1.0 mL鹽酸標準滴定溶液相當的氮的質量，g；m為試樣的質量，g；F為氮換算為蛋白質的系數，花生為5.46；100為換算系數。

2 結果與分析

2.1 不同消解溫度對花生蛋白質含量的影響

由圖1可知，在消解時間為1.5 h、濃硫酸用量為10 mL的條件下，隨著消解溫度的升高，花生蛋白質的含量呈先升高后降低的趨勢，消解溫度為

420 ℃時，花生蛋白質的含量明顯高于其余消解溫度時的含量，可能是由于消解溫度低時，樣品消解不完全；當消解溫度過高時，含氮物質以氣體形式損失，造成測定結果偏低[3]。因此，選擇420 ℃為最適溫度。

圖1 不同消解溫度對花生蛋白質含量的影響

2.2 不同硫酸用量對花生蛋白質的影響

由圖2可知，在消解溫度為420 ℃、消解時間為1.5 h的條件下，隨著濃硫酸用量的增加，花生蛋白質含量呈現增加的趨勢，當濃硫酸加入量在10 mL以上時，花生蛋白質的含量基本穩定。如果濃硫酸用量少，會導致花生樣品無法完全分解，測定結果可能偏低[4-5]；如果用量過多，會造成試劑浪費并產生環境污染。因此，選擇10 mL為硫酸的最適用量。

圖2 不同硫酸用量對花生蛋白質的影響

2.3 不同消解時間對花生蛋白質的影響

由圖3可知，在消解溫度為420 ℃、濃硫酸用量為10 mL的條件下，消解時間為1.5 h時，花生蛋白質的含量明顯高于消解時間為0.5 h時的含量，略高于消解2.0 h的花生蛋白質含量。當消解時間為

2.5 h時，花生蛋白質的含量下降。消解時間對花生蛋白質含量的影響很大，如果消解時間太短，消解液體并不呈綠色透明狀，而是呈黑色；消解時間過長，會造成氮的流失，因此最適宜消解時間為1.5 h。

圖3 不同消解時間對花生蛋白質的影響

2.4 空白試驗、回收試驗和重復性試驗的測定結果

由表1可知，7次測定空白試樣的標準鹽酸滴定用量均值為0.097 mL。由表2可知，用全自動凱氏定氮儀進行準確性試驗，7次回收試驗測得硫酸銨基準試劑的含氮量均值為21.15 g/100 g，硫酸銨回收率為99.8%；由表3可知，利用本文優化后的試驗條件，進行精密度試驗，7次平行測定花生平均值為

22.14 g/100 g，RSD為0.16%，以上試驗結果表明本文優化后的測定方法具有較高的準確性和精密度。

3 結論

本文利用凱氏定氮法測定花生蛋白質含量，分析不同條件對花生蛋白質含量的影響。結果顯示，優化后的試驗條件為稱樣量0.3 g（精確至0.000 1 g），硫酸用量為10 mL，消解溫度設定為420 ℃，消解時間為1.5 h。通過回收試驗和重復性試驗等結果可以看出，該方法適合花生蛋白質的含量測定，為高效、準確測定花生蛋白質的含量提供參考。

參考文獻

[1]LYNCH J M，BARBANO D M.Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products[J].Journal of Aoac International，1999（6）：1389-1398.

[2]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定：

GB /T 5009.5—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

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