MEBT/MEBO對糖尿病大鼠難愈合創面中ZEB1/LAMA3/ITGA3信號通路表達的影響

黃金梅,唐 婷,韋柳葉,左遠娟,賀佐分,龔元勛,姜 艷,郭文聞,譚 奔,唐乾利,

(1. 廣西中醫藥大學研究生院,廣西 南寧 530200;2. 右江民族醫學院研究生學院,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫學院附屬醫院,廣西 百色 533000;4. 右江民族醫學院/桂西高發病防治重點實驗室,廣西 百色 533000)

糖尿病引發創面難愈合的現象非常普遍,常導致殘疾甚至死亡［1-2］。糖尿病難愈合創面的病因復雜,即使愈合后亦會復發［3］。其治療問題在患者健康和經濟方面都變得繁重,因此創面修復、皮膚再生仍是一個重要的公共衛生問題和挑戰［4］。皮膚再生醫療技術立足于中西醫結合理論,強調原位再生,秉承整體觀念,具有顯著的止痛、抗感染、促進創面愈合、減少瘢痕等作用。唐乾利教授課題組從宏觀到微觀系統闡述了該技術治療慢性難愈合創面的作用靶點［5-6］,但對創面表皮再上皮化機制仍知之甚少。據研究發現,細胞外基質(ECM)的層黏連蛋白3(LAMA3)與角質形成細胞的整合素α3(ITGA3)結合可調節細胞黏著、遷移等［7］。E盒結合鋅指蛋白(ZEB)家族成員ZEB1可直接調節LAMA3的表達,影響細胞的活動［8］。而ZEB1/LAMA3/ITGA3信號通路是否在糖尿病難愈合創面修復中起到作用,皮膚再生醫療技術對此信號通路是否有調節作用,其背后的機制尚未明確。故本實驗采用濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏(MEBT/MEBO)干預糖尿病大鼠難愈合創面,基于ZEB1/LAMA3/ITGA3信號通路探討了該療法對創面表皮區再上皮化的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠80只,12周齡,體重200～250 g,購自長沙市天勤生物技術有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-0013。嚴格遵照右江民族醫學院實驗動物倫理委員會標準,于SPF級動物房飼養。室溫20～26 ℃,相對濕度 45%～55%,晝夜循環,保持12 h光照,分籠飼養,自由飲食飲水。

1.2主要儀器與試劑 自動脫水機(型號:Excelsior AS,江蘇維林科生物技術有限公司),包埋機(型號:HistoStarTM,江蘇維林科生物技術有限公司),切片機(型號:HM325,北京恒三江儀器銷售有限公司),共聚焦顯微鏡(型號:STELLARIS 5,徠卡顯微系統貿易有限公司),熒光定量PCR(型號:LightCycler 96,上海微速生物科技有限公司);MEBO(汕頭市美寶制藥有限公司,國藥準字Z20000004);貝復新(珠海億勝生物制藥有限公司,國藥準字S20040001);鏈脲佐菌素(STZ)、HE、Masson試劑(北京索萊寶科技有限公司);LAMA3 antibody(武漢博歐特生物科技有限公司);二抗(賽默飛世爾科技有限公司);LAMA3 、ITGA3、ZEB1引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3實驗方法 大鼠適應性喂養7 d后,隨機抽取18只作為急性創面組,其余62只腹腔注射STZ制備糖尿病創面模型。糖尿病造模方法參考文獻［9］:大鼠禁食12 h,采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2)將STZ稀釋成1%的溶液,按照50 mg/kg左下腹腔快速注射,急性創面組腹腔注射同等劑量緩沖液。連續注射3 d后,以空腹血糖≥16.7 mmol/L為標準;若模型不成功,再次禁食12 h后,補充1% STZ溶液10 mg/kg同法注射。創面造模方法參考文獻［10］:糖尿病造模成功后,根據全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環肉芽腫定量法制備創面模型。固定大鼠四肢,將其背部朝上,先剃去背部毛發,再以脫毛膏脫毛,為消除脫毛劑對皮膚的影響,用清水洗滌并擦干背部皮膚。脫毛24 h后,通過小動物麻醉機讓大鼠吸入2.5%異氟烷麻醉,在無菌條件下,沿脊椎方向用外科方法做2條深達筋膜、直徑為30 mm的圓形全層皮膚缺損創面。將糖尿病創面造模成功54只大鼠(剩余大鼠作為本實驗同批次糖尿病大鼠備選)隨機分為MEBT/MEBO組、貝復新組、糖尿病創面組,每組18只。各組大鼠開始換藥干預,每日2次。換藥前均以1/5 000呋喃西林液清潔創面,MEBT/MEBO組外敷2層MEBO紗條(0.2 g/cm2),貝復新組外敷2層貝復新浸透紗布(60 IU/cm2),糖尿病創面組和急性創面組外敷2層生理鹽水紗布,然后均外用膠布“豐”形固定2層消毒干紗布。

1.4創面組織取材方法 各組于造模后第3,7,14天分別隨機取6只大鼠麻醉,從深筋膜下層切取距離創緣0.5 cm的整個創面。將標本無張力地平展在濾紙上,小心把標本對半切開,一半用稱量紙包裹固定形狀后放入10%的中性緩沖液福爾馬林中,24 h后再放入70%的酒精中,置于4 ℃冰箱。另外一半置于凍存管中,放入液氮中-80 ℃保存。

1.5檢測指標及方法

1.5.1創面愈合情況 拍攝每組大鼠造模后當天及第3,7,14天創面圖片,通過Image J軟件計算創面面積,按照公式計算創面愈合率［創面愈合率=(初始創面面積-所拍照時間點創面面積)/初始創面面積×100%］。

1.5.2創面組織病理形態 將福爾馬林處理后的組織放于自動化脫水儀器脫水后進行包埋,切片厚度為4 μm,進行2個二甲苯循環脫蠟透明,每步10 min;接著以無水乙醇5 min-無水乙醇5 min-90%乙醇5 min-80%乙醇5 min-70%乙醇5 min-純水5 min進行組織水化;分別進行HE染色、Masson染色;最后進行乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡下分析。

1.5.3創面組織中LAMA3蛋白陽性表達情況 取制備好的組織切片,按常規方法脫蠟至水,經檸檬酸鹽抗原修復液修復后,滴加驢血清,室溫封閉1 h。滴加LAMA3一抗(比例1∶50)于切片樣本上,并將切片放于濕盒中,4 ℃冰箱過夜。孵育二抗前進行洗片3次,每次10 min;滴加二抗(比例1∶500),常溫下1 h,敷二抗后均避光操作。再次洗片3次,每次10 min,DAPI常溫下染色8 min,洗片3次,每次5 min,最后用50%甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察,并使用Image J分析結果。

1.5.4創面組織中LAMA3、ITGA3、ZEB1mRNA表達情況 取適量凍存創面組織,按說明書1∶10比例添加Trizol裂解液,提取組織總RNA。在冰上使用高壓消毒后的剪刀將浸沒在裂解液中的組織剪碎,接著將組織放入全自動樣品快速研磨儀中研磨2 min;先后加入200 μL氯仿、0.5 mL異丙醇,期間12 000 r/min離心收取上清液。添加75%乙醇進行純化,接著用DEPC水溶解RNA,紫外可見分光光度計測定其濃度,放于-80 ℃ 冰箱待用。采用BeyoRTTMII cDNA第一鏈合成試劑盒(RNase H-)反轉錄操作,20 μL反轉錄體系中反轉錄合成cDNA。依照HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix進行操作,采用熒光定量PCR儀,根據2-△△Ct法分析數據的相對定量。引物序列:ITGA3上游為5’-GGGTGCCGTCTATGTCT-3’,下游為5’-TCTCCGTGGATTATCTGCT-3’;LAMA3上游為5’-GCGAACCAACACCCTCCT-3’,下游為5’-CACCGACACTGATGTCCTTTAT-3’;ZEB1上游為5’-AAAGTGGCTGTAGATGGTA-3’,下游為5’-ACTCACGGCTTCTTGCTC-3’;GAPDH上游為5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’,下游為5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。

1.6統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據統計分析。計量資料滿足正態分布且方差齊,多組間比較采用單因素分析,兩兩比較采用LSD檢驗;若方差不齊,采用蓋姆斯-豪厄爾(A)法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組創面愈合情況 造模后第3天,急性創面組大鼠創面潤澤,糖尿病創面組大鼠創面色澤略顯晦暗,各組創面愈合率比較差異無統計學意義(P均>0.05)。造模后第7天,糖尿病創面組創面稍大且存在分泌液,邊界模糊,表面覆蓋較厚的暗紅色組織物;MEBT/MEBO組、貝復新組和急性創面組大鼠創面邊界清晰,面積縮小,創面愈合率均明顯高于糖尿病創面組(P均<0.05),MEBT/MEBO組創面愈合率與貝復新組比較差異無統計學意義(P>0.05)。造模后第14天,糖尿病創面組創面明顯縮小,較之前干燥,邊緣清晰,但仍有少許分泌物;MEBT/MEBO組、貝復新組和急性創面組大鼠創面均明顯縮小,創面愈合率均明顯高于糖尿病創面組(P均<0.05),MEBT/MEBO組創面愈合率與貝復新組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 急性創面組和糖尿病創面各組大鼠造模后不同時間點創面愈合情況

圖2 急性創面組和糖尿病創面各組大鼠造模后不同時間點創面愈合率

2.2各組創面組織HE染色病理形態 造模后第3天,各組大鼠創面組織中均存在明顯炎癥細胞和紅細胞浸潤,創面邊緣的表皮層增厚。造模后第7天,糖尿病創面組大鼠創面組織中炎性細胞較多,雖然邊緣表皮增厚,但形成的表皮向創面遷移長度較短;MEBT/MEBO組、貝復新組和急性創面組大鼠創面均出現散在的肉芽組織,炎癥浸潤減輕,邊緣表皮增厚并明顯向創面中心遷移。造模后第14天,糖尿病創面組大鼠創面炎癥細胞浸潤減輕,但表皮再上皮化尚未完全;MEBT/MEBO組、貝復新組和急性創面組大鼠部分創面的表皮覆蓋完全,并生成毛囊胚、皮脂腺、血管等。見圖3。

圖3 急性創面組和糖尿病創面各組大鼠造模后不同時間點創面組織HE染色表現(×200)

2.3各組創面組織Masson染色情況 造模后第3天,各組大鼠創面組織中膠原纖維細小,紅細胞較多。造模后第7天,糖尿病創面組大鼠創面組織中膠原纖維染色較少且分布不均勻;MEBT/MEBO組、貝復新組、急性創面組大鼠創面組織中均可見分布和排列均勻的膠原纖維,同時有血管新生。造模后第14天,糖尿病創面組大鼠創面組織中有少量膠原纖維,且呈稀疏結構;MEBT/MEBO組、貝復新組、急性創面組大鼠創面組織中存在明顯增多且粗大、密集分布的膠原纖維。見圖4。

圖4 急性創面組和糖尿病創面各組大鼠造模后不同時間點創面組織Masson染色表現(×200)

2.4各組創面組織中LAMA3蛋白陽性表達情況LAMA3蛋白分布在表皮層與真皮層之間,表達于向創面中心遷移的新生基底膜中,在創面邊緣遠端的正常皮膚結構中的基底膜幾乎不表達。糖尿病創面組第3,7,14天創面組織中LAMA3蛋白陽性表達光密度值均明顯低于其他組(P均<0.05),MEBT/MEBO組與貝復新組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖5及圖6。

圖5 急性創面組和糖尿病創面各組大鼠造模后不同時間點創面組織中LAMA3蛋白陽性表達情況(免疫熒光染色,×200,×800)

圖6 急性創面組和糖尿病創面各組大鼠造模后不同時間點創面組織中LAMA3蛋白陽性表達光密度值

2.5各組創面組織中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA 表達情況 造模后第3,7,14天,糖尿病創面組創面組織中LAMA3、ITGA3 mRNA表達量均明顯低于其他組(P均<0.05),ZEB1 mRNA表達量均明顯高于其他組(P均<0.05),MEBT/MEBO組創面組織中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA表達量與貝復新組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);MEBT/MEBO組中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA表達量與貝復新組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖7。

圖7 急性創面組和糖尿病創面各組大鼠創面組織中LAMA3 、ITGA3、ZEB1mRNA相對表達量

3 討 論

糖尿病患者易合并糖尿病足部潰瘍等難愈合創面病變,且常出現再上皮化功能障礙,并加快創面病理學進程［3］。研究表明,創面中的細胞常以角質形成細胞為主導,在傷口基質上持續遷移,以密封表皮斷層、恢復表皮結構和屏障功能,創面再上皮化被用作評估傷口愈合的參數［11-12］。課題組前期研究發現,MEBT/MEBO能夠通過作用于角質形成細胞,進而加快創面的愈合,但是其具體作用機制仍不明確。

現有研究發現,LAMA3和ITGA3是皮膚創面愈合的關鍵調節因子,可使參與再上皮化的角質形成細胞沿著富含纖維蛋白/層黏連蛋白的ECM向創面中心遷移［7,13-14］。ECM是組成細胞外微環境的基礎,對細胞遷移、增殖、凋亡等有重要調控作用,其重塑在創面愈合中具有促進再上皮化和血管新生等作用［15］。故本研究從角質形成細胞促進創面愈合的機制開展研究,旨在為治療糖尿病難愈合創面提供理論依據。

本實驗結果顯示,造模后第7,14天,糖尿病創面組創面愈合率均明顯低于其他組;造模后第14天,病理觀察顯示糖尿病創面組創面仍有炎癥浸潤,表皮再上皮化不全,創面組織中LAMA3蛋白表達光密度值和LAMA3、ITGA3mRNA表達量均明顯低于其他組。提示LAMA3、ITGA3的表達與再上皮化有關,二者在糖尿病難愈合創面中表達減少,與文獻［16-17］實驗結果一致。MEBT/MEBO組LAMA3蛋白表達光密度值和LAMA3、ITGA3mRNA表達量與急性創面組、貝復新組比較差異均不明顯,提示MEBT/MEBO能上調創面組織中LAMA3和ITGA3表達。

ZEB1被認為是腫瘤細胞的上皮-間質轉化轉錄激活劑,其可直接調節LAMA3的表達,從而影響再上皮化進程［11］;可減弱角質形成細胞黏附作用,并阻止其向創面中心定向遷移,影響再上皮化,導致表皮屏障的完整性受損［16-18］。ZEB1還可以血糖狀態依賴的方式調控創面血管的生成和閉合,適度的表達可促進創面血管生成,極端過表達則可導致血管內皮功能喪失和持續性炎癥反應［19-20］。本實驗結果顯示,糖尿病創面組創面組織中ZEB1 mRNA表達量高于急性創面組、MEBT/MEBO組和貝復新組;病理觀察顯示糖尿病創面組的創面邊緣表皮增厚但遷移較慢,且創面持續炎癥浸潤,新生血管少,這可能與該組ZEB1表達失衡有關。急性創面組、MEBT/MEBO組和貝復新組創面組織出現新生血管,膠原纖維排列有序,表皮遷移較快,提示MEBT/MEBO可下調ZEB1表達,促進創面血管新生和再上皮化。

綜上,糖尿病大鼠難愈合創面再上皮化遲緩,可能與ZEB1表達過高,從而影響與創面細胞黏附、定向遷移相關的LAMA3、ITGA3表達不足有關;MEBT/MEBO干預可上調LAMA3、ITGA3表達,相對下調ZEB1表達,以創造良好的愈合組織微環境,促進再上皮化。但因再上皮化修復機制的復雜性、重疊性,同時ZEB1僅在腫瘤、癌癥領域研究較多,ZEB1/LAMA3/ITGA3信號通路在創面修復的相關研究仍需更深入的探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。