銀杏葉提取物EGb761對急性抑郁樣小鼠行為學及海馬炎性細胞因子的影響

周家建,王學永,柴洪燕,劉 璇,馬新越,趙約翰

(1. 濰坊醫學院臨床醫學院,山東 濰坊 261042;2. 濰坊市濰城區人民醫院,山東 濰坊 261000;3. 濰坊市人民醫院,山東 濰坊 261041)

抑郁癥是一種嚴重的精神疾病,近年來其發病率顯著升高,大約影響全球20%的人口［1］。世界衛生組織預計,2030年抑郁癥將會成為人類喪失工作能力和死亡的最主要原因［2-3］。抑郁癥的病因尚不完全清楚,既往研究認為單胺類神經遞質紊亂、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂、神經營養因子缺乏等均與之有關,近年來對抑郁癥的研究提出“細胞因子假說”,認為炎癥過程和腦-免疫相互作用與抑郁癥的發病密切相關［4-6］。腦源性神經營養因子(BDNF)是一種對軸突的生長、神經元的存活和突觸的可塑性具有至關重要作用的神經營養肽,參與抑郁癥的發病［7］。有證據表明,炎癥因子能降低機體BDNF水平,炎癥因子和BDNF在抑郁癥中起重要作用［8-9］。銀杏葉提取物EGb761具有抗炎、抗氧化、抗動脈硬化和神經保護作用,可預防記憶減退和中樞神經系統疾病的發生,改善情緒和認知功能［10-11］,但其是否具有抗抑郁作用及是否對脂多糖(LPS)誘導的抑郁模型具有抗抑郁樣作用還未可知。本研究通過單次腹腔注射LPS制備急性抑郁樣小鼠模型,觀察EGb761預處理對小鼠行為學和海馬組織中炎性細胞因子、BDNF表達的影響,旨在探討EGb761抗抑郁作用及其機制,為銀杏葉提取物用于抑郁癥的治療提供理論依據。

1 實驗材料和方法

1.1實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠40只,8周齡,體重20～25 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(滬)2012-0002。實驗開始前7 d適應新的實驗環境,小鼠自由飲食攝水,實驗遵循國家《實驗動物管理條例》的動物飼養及實驗要求。

1.2主要試劑 EGb761(金納多片,德國威瑪舒培博士藥廠,規格:20 mg/片);LPS(美國Sigma公司);小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-17A(IL-17A)、白細胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);BDNF ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3主要儀器 ZH-ZFT型聯合曠場實驗視頻分析系統、ZH-QPT型強迫游泳實驗視頻分析系統、ZH-XWT型懸尾實驗視頻分析系統(安徽正華生物儀器設備有限公司);iMark酶標儀(美國BIO-RAD公司)。

1.4實驗方法 將40只小鼠隨機分為對照組、模型組、EGb761低劑量組、EGb761中劑量組和EGb761高劑量組,每組8只。EGb761低、中、高劑量組小鼠分別給予EGb761(生理鹽水溶解)50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)、150 mg/(kg·d)灌胃12 d,于第10天腹腔注射LPS 0.83 mg/kg(該劑量可引起疾病的急性反應和隨后的抑郁樣行為);模型組小鼠給予EGb761等量的生理鹽水灌胃12 d,于第10天腹腔注射LPS 0.83 mg/kg;對照組小鼠給予EGb761等量的生理鹽水灌胃12 d,于第10天腹腔注射等量的生理鹽水。

1.5檢測指標及方法

1.5.1曠場實驗 腹腔注射LPS 24 h后,選用長100 cm、寬100 cm、高50 cm,周壁為黑色,地面為白色的敞箱進行曠場實驗,評估小鼠的自發活動。敞箱地面用黑線劃分為面積相等的25塊,敞箱中央上方懸掛一只100 W的燈泡,在黑暗、安靜的房間中進行實驗。實驗開始時,將小鼠置于清潔敞箱中央,錄制實驗小鼠的活動,使用ZH-ZFT型聯合曠場實驗視頻分析系統分析并記錄小鼠的水平運動得分(穿過地面的方塊數)和垂直得分(站立次數),每只小鼠觀察時間為5 min。為避免前一只小鼠的殘留信息影響其他小鼠的測試結果,在新的實驗開始前用75%的酒精清洗敞箱周璧及地面。

1.5.2強迫游泳實驗 腹腔注射LPS 24 h后,選用直徑12 cm、高40 cm的透明圓桶于夜間進行強迫游泳實驗。桶內水深10 cm,水溫保持(24±1)℃。實驗第1天小鼠強迫游泳15 min,取出后于25 ℃溫室烘干歸籠;第2天,小鼠強迫游泳6 min,第2分鐘開始使用ZH-QPT型強迫游泳實驗視頻分析系統記錄分析后續4 min內小鼠的不動時間。實驗結束后,將小鼠迅速取出,于25 ℃溫室烘干歸籠。為避免前一只小鼠的殘留信息影響其他小鼠的測試結果,在新的實驗開始前更換實驗桶中的水。

1.5.3懸尾實驗 腹腔注射LPS 24 h后,使用夾子夾住小鼠尾部距末端約3 cm處并倒吊于距地面30 cm左右的橫桿上,實驗總時長為6 min,第2分鐘開始使用ZH-XWT型懸尾實驗視頻分析系統記錄并分析后續 5 min內小鼠的不動時間。實驗結束后,輕取小鼠并歸籠。為避免前一只小鼠的殘留信息影響其他小鼠的測試結果,在新的實驗開始前對試驗場所進行通風消毒。

1.5.4蔗糖水實驗 實驗分為訓練實驗和正式實驗兩部分,實驗在隔噪音、安靜的房間中進行。正式實驗開始前48 h對實驗小鼠進行蔗糖水飲用訓練,每籠放置2個水瓶,第一個24 h,兩瓶均為1%的蔗糖水100 mL;第二個24 h,1瓶為1%蔗糖水100 mL,1瓶為純凈水100 mL。腹腔注射LPS 24 h并禁水(24 h)后,開始進行糖水及純水消耗實驗,每籠放置2個水瓶(1%蔗糖水和純凈水各100 mL)。4 h后,測定小鼠的蔗糖水和純水消耗量,計算蔗糖水偏愛率。蔗糖水偏愛率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.5.5海馬組織中炎性因子和BDNF含量檢測 小鼠腹腔注射LPS 48 h后,斷頭取腦組織,置于冰上剝離海馬并稱重,充分漂洗海馬組織后加入定量的PBS制備海馬組織勻漿,于-20 ℃條件下進行凍融循環破壞細胞膜,取勻漿液,4 ℃下5 000× g離心15 min,取上清液分裝并保存在-20 ℃。按照ELISA試劑盒內的說明書測定海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-10和BDNF含量。

1.6統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析,計量資料均符合正態分布,各組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠自發活動得分比較 模型組和EGb761各組小鼠的垂直得分、水平得分均明顯低于對照組(P均<0.05),模型組和EGb761各組間垂直得分、水平得分比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 對照組和急性抑郁樣各組小鼠自發活動垂直得分和水平得分

2.2各組小鼠強迫游泳不動時間和懸尾不動時間比較 模型組小鼠的強迫游泳不動時間和懸尾不動時間均明顯長于對照組(P均<0.05),EGb761中、高劑量組小鼠的強迫游泳不動時間和懸尾不動時間均明顯短于模型組(P均<0.05),且隨EGb761劑量增加而逐漸縮短。見圖2。

圖2 對照組和急性抑郁樣各組小鼠強迫游泳不動時間和懸尾不動時間

2.3各組小鼠蔗糖水偏愛率比較 模型組小鼠的蔗糖水偏愛率明顯低于對照組(P<0.05);EGb761中、高劑量組小鼠的蔗糖水偏愛率均明顯高于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組明顯高于EGb761低劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 對照組和急性抑郁樣各組小鼠蔗糖水偏愛率

2.4各組小鼠海馬組織中炎癥細胞因子含量比較模型組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量均明顯高于對照組(P均<0.05),IL-10 含量均明顯低于對照組(P<0.05)。EGb761中、高劑量組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量均明顯低于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組各指標含量均明顯低于EGb761低、中劑量組(P均<0.05);EGb761中、高劑量組小鼠海馬組織中IL-10 含量均明顯高于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組均明顯高于EGb761低、中劑量組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 對照組和急性抑郁樣各組小鼠海馬組織中炎性細胞因子含量

2.5各組小鼠海馬組織中BDNF含量比較 模型組小鼠海馬組織中BDNF含量明顯低于對照組(P<0.05);EGb761中、高劑量組小鼠海馬組織中BDNF含量均明顯高于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組均明顯高于EGb761低、中劑量組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 對照組和急性抑郁樣各組小鼠海馬組織中BDNF含量

3 討 論

LPS誘導模型是公認的炎癥相關的抑郁癥動物模型［12］。本實驗采用該方法構建抑郁模型,結果顯示模型組小鼠強迫游泳不動時間和懸尾不動時間顯著延長,對蔗糖水偏愛率降低,證實LPS腹腔注射誘導小鼠的急性抑郁樣行為模型成功;EGb761各劑量組與模型組相比,小鼠強迫游泳不動時間和懸尾不動時間隨EGb761暴露劑量增加而縮短,蔗糖水偏愛率升高,表明EGb761能改善LPS誘導的小鼠快感缺乏。Rojas等［13］研究表明,EGb761能夠縮短BALB/c小鼠強迫游泳不動時間,本研究結果與之具有一致性。另外人們普遍認為自發活動的改善可以縮短強迫游泳不動時間和懸尾不動時間,但本研究曠場實驗結果顯示,模型組和EGb761各組間小鼠的垂直得分和水平得分比較均無明顯差異,因此推斷強迫游泳不動時間和懸尾不動時間的縮短不是由自發活動改善所致,而是由EGb761抗抑郁作用所介導。

抑郁癥可激活免疫系統,促進細胞因子的分泌,而細胞因子也能夠改變個體的情緒和行為。抑郁癥促炎性細胞因子與抗炎性細胞因子的激活是共同發生的,促炎性細胞因子如IL-1、IL-6 、TNF-α等參與免疫激活和炎癥的發生［14］,而抗炎性細胞因子如IL-10等通過平衡促炎細胞因子的表達來影響抑郁行為［15］。Wu等［16］研究報道,抑郁癥患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高。Ogodek［17］研究表明,抑郁癥患者的血清IL-1β、IL-4、IL-8水平隨著抑郁癥的加重而增高,而血清IL-10水平明顯降低。Pan等［18］認為IL-10可以逆轉強迫游泳應激誘導的抑郁樣行為。Kim等［19］研究報道,IL-17在抑郁癥的發病機制中扮演重要角色,累積的輕度應激可通過上調IL-17導致抑郁癥狀的持續存在。本研究發現,腹腔注射LPS可誘導小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量升高和IL-10含量降低,與文獻［13］報道相一致;預先給予中劑量和高劑量EGb761均可顯著抑制小鼠海馬組織中IL-10含量的降低以及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量的升高。表明EGb761預處理可抑制炎癥并激活抗炎反應,促使機體免疫系統恢復平衡。

抑郁癥患者血清BDNF水平較正常人群顯著下降［20］,而外周血與中樞系統中的BDNF 表達水平密切相關,提示抑郁樣行為在本質上與大腦 BDNF表達有關［21］。中樞給予BDNF可在小鼠抑郁模型中產生抗抑郁樣活性,說明BDNF對抑郁癥具有保護作用［8］。本研究發現,腹腔注射LPS可誘導小鼠海馬組織中BDNF含量降低,而中劑量和高劑量EGb761預處理可顯著抑制海馬組織中BDNF的降低。因此認為上調小鼠海馬組織中BDNF含量可能會改善LPS誘導的小鼠抑郁樣行為。

綜上所述,EGb761能明顯改善LPS誘導的小鼠急性抑郁樣行為,其可能是通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A產生,上調海馬組織中BDNF及IL-10含量實現的。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。