大曲酶系的研究現狀及展望

翁 鵬，張建敏，彭志云，鄭 佳，，3，趙 東，，3*

(1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 643002；2.宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000；3.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000)

大曲是以小麥為主，配以豌豆、大麥等原料制成的磚塊狀曲塊[1]，其制作過程分為三個階段，物料被粉碎、混合和壓制定型，在特定的溫濕度下進行培曲管理，最后進入曲庫進行進一步的干燥和陳化[2]。白酒香型眾多，用于釀造酒的曲同樣多種多樣，白酒大曲按香型可分為濃香型大曲、醬香型大曲、清香型大曲；按制曲溫度可分為高溫大曲、中溫大曲和低溫大曲；按工藝可分為傳統大曲、純種大曲和強化大曲[3]。作為白酒發酵劑，大曲在白酒釀造中起到提供菌源、糖化發酵、投糧和生香四大作用。在培養過程中，環境微生物自然富集到大曲上，如五糧液包包曲獨特的包包造型，便是典型的微生物收集器，有利于有益微生物的生長，培養完成并通過一定時間的儲存后，可為白酒的發酵提供豐富的菌系、酶系，保證白酒的穩定生產。現在對糖化和發酵作用了解太過籠統，還停留在糖化力、液化力等宏觀層次的研究，應該進一步從微觀即糖化酶、液化酶以及其他酶之間的協同作用入手分析，找出起主要作用的單個酶或組合酶。大曲所含酶系豐富，主要包括淀粉酶類、纖維素酶類、蛋白酶類、脂肪酶、單寧酶和果膠酶等[3]。曲中酶類主要是微生物代謝或次級代謝產生，發酵過程中的微生物群落對水分、溫度和酸度的變化非常敏感，因此發酵過程中的理化性質可影響微生物代謝從而影響酶類的產生，但理化性質與大曲酶系并無直接關聯性。質量不一致的大曲，會增加生產成本和降低發酵效率，影響白酒的生產過程。大曲質量不一可能是由微生物群落分泌的酶系種類、數量差異較大引起的，隨著現代生物技術的發展[4]，對大曲酶系的有更多直觀的研究，本文將對白酒大曲酶系的研究做出概述。

1 大曲酶系組成

酶是由活細胞產生，具有催化功能的蛋白質[5]。一切微生物的生命活動都離不開酶，大曲及釀酒培養各種微生物的目的，就是利用微生物產生的酶系進行龐大、復雜的生化反應。大曲中的酶根據催化功能可分為糖化酶、液化酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、酯化酶、漆酶、脂肪酶、纖維素酶、木聚糖酶、單寧酶、植酸酶、果膠酶等[1]。

1.1 液化酶

液化酶又稱α-淀粉酶（EC3.2.1.1），主要作用是切斷淀粉分子內部的α-1,4-葡萄糖苷鍵，將淀粉水解成糊精和小分子糖，使黏度下降，提高發酵過程中的糖化效率，在70 ℃左右活性較高[6]。液化酶主要來源于枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉[7]。為了提高實際釀造中的出酒率，篩選高產液化酶菌已經成為一種趨勢。劉延波等[8]從賒店老酒大曲中篩選出了1 株耐高溫的根霉菌B8，在最適條件下，該菌產的液化酶和糖化酶活力分別為41.57 U/g 和162.38 U/g；陳闊[9]從邵陽地區大曲中篩選出WB4、WB9、WB13 3 株產淀粉酶菌株，其中WB4 在酸性環境中可產酶達2.877 U/mL，這一研究使得釀酒生產中可直接添加此菌，使液化力增高，有望提高白酒產量。

1.2 糖化酶

糖化酶又稱γ-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要作用于淀粉非還原性末端的α-1,4-葡萄糖苷鍵，可將淀粉以及液化酶生成的糊精水解成葡萄糖[10]。主要來源于黑曲霉、根霉、擬內孢霉、紅曲霉[11]。值得注意的是，真菌α-淀粉酶也可生成少量葡萄糖[12]。范斌強[13]在包包曲中添加黑茶菌，促進了霉菌生長，抑制了細菌和酵母菌生長，顯著提高了糖化酶活力，添加20%黑茶菌時，糖化酶活力提高了12%左右。往酒曲中添加適當的霉菌，能提高酒曲的糖化力，同時風味物質的量也會受到影響[14]，控制好酒曲中霉菌的量，使產酒量與風味物質達到平衡，將會是下一個目標。

1.3 蛋白酶

蛋白酶[15]是水解蛋白質肽鍵的酶，根據作用pH 值的不同可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶。在釀酒過程中，蛋白質在蛋白酶的作用下，生成游離氨基酸，繼而生成白酒眾多風味物質的一部分。酸性蛋白酶主要由酶菌產生，如青霉、根霉和曲霉，少部分細菌也能產酸性蛋白酶[11]。李學思[16]以產蛋白酶活達114.8 U/mL 的菌株MSPN-11 進行紫外誘變得到高產蛋白酶菌株MSPR8，酶活相比前者提高了26.38 %；馮利芳[17]從清香型低溫大曲中分離出一株產中性蛋白酶的短小芽孢桿菌GF-6，所產中性蛋白酶最適溫度為50 ℃，最適pH7，在此條件下酶活達到202.7 U；王芙蓉[18]從醬香大曲中篩選出1 株高產蛋白酶的高溫放線菌GW2，在45 ℃、pH6.5、培養5 d 的優化條件下，該菌產酶提高了0.2 倍，可達214.99 U/g。經證實，在液態大曲酒發酵過程中加入適量酸性蛋白酶可有效降低高級醇含量[19]，有助于液態發酵的實現，在微觀層面上，黃蓉[20]將酸性蛋白酶基因定點整合到釀酒酵母的基因位點，獲得的重組菌株可實現酸性蛋白酶利用與酒精發酵的同步進行，使酒精發酵效率得到極大提升。

1.4 纖維素酶

纖維素酶（EC3.2.1.4）不是單一的一種酶，而是起協同作用的多組分酶系，包含C1酶（外切β-葡聚糖酶）、Cx 酶（內切β-葡聚糖酶）和β 葡糖苷酶（β-葡萄糖苷酶）。在分解纖維素的過程中C1 酶首先破壞纖維素的晶體結構，接著Cx 酶作用于β-1，4-糖苷鍵，最后經β葡糖苷酶作用生成葡萄糖。纖維素酶在釀造過程中起著重要作用，一方面它將釀造原料高粱、玉米中的纖維素轉化為可發酵糖，另一方面，破壞原料中的細胞壁，使胞內淀粉釋放，更易于淀粉酶作用[21]。釀造過程中的纖維素酶主要來源于木霉、曲霉、根霉和青霉[22]。羅明有[23]從濃香型白酒糟醅中篩選出了產纖維素酶的酵母菌株S533Y-36，在pH5.8、32 ℃的條件下培養36 h，酶活為1.84 U/mL。比起酵母菌株，大曲中芽孢桿菌產纖維素酶的能力明顯更強，龔麗瓊[24]從高溫大曲中篩選出了產纖維素酶的芽孢桿菌，經優化后酶活達1643.27 U/mL；劉延波等[25]從大曲中分離出了高產纖維素酶的枯草芽孢桿菌，在其最佳產酶條件（接種量4 %、培養3 d、pH4）下，產纖維素酶活力高達1014 U/mL；陽剛[26]發現提升纖維素酶活力使白酒糟的降解率提高了70 %，有助于對白酒糟進行更高效的利用。纖維素酶還能降低雜醇油以及醛類物質含量[27]，使所產酒的風味、口感更佳。

1.5 木聚糖酶

木聚糖酶（EC3.2.1.8）也稱半纖維素酶，是可將木聚糖降解為低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括β-1,4-內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素[28]。由于釀酒原料淀粉外層含有半纖維素，木聚糖酶協同纖維素酶破壞釀酒糧食細胞結構，釋放淀粉、蛋白質等，從一定程度上提高了淀粉酶活力[29]。酸性木聚糖酶的最適pH 值為3.5～6.0,適宜溫度為40～60 ℃。徐曼等[28]進行白酒釀造實驗，發現添加木聚糖酶組的酒度是對照組的130.47%，且實驗組的殘糖含量僅為對照組的7.4%。

1.6 單寧酶

單寧酶又稱鞣酸酶或單寧酯酰水解酶，可破壞單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖[30]。在發酵中，單寧酶將單寧降解成白酒風味物質，且不同單寧酶可使單寧降解為不同的風味物質[31]，主要來源于黑曲霉、米曲霉和黃曲霉[32]。薛江林等[33]以酶制劑澄清法解決紅茅燒酒的沉淀問題，以控制變量法分別探究了支鏈淀粉酶、中心蛋白酶、糖化酶以及單寧酶的最佳添加量，發現添加0.006%單寧酶的澄清效果最好。

1.7 果膠酶

果膠酯是能夠分解果膠物質的酶的總稱[34]，包括原果膠酶（PG，EC3.2.1.15）、果膠酯酶（PE，EC3.1.1.11）、果膠水解酶（PH）和果膠裂解酶（PL，EC4.2.2.10），主要作用就是將果膠質中的糖苷鍵分解，使果膠轉化成半乳糖醛酸[35]。果膠是植物細胞壁的重要組成部分，所以果膠酶能破壞釀造原料細胞壁，促進胞內淀粉分子的釋放，同時具有一定澄清液體的作用，有實驗表明，超過50 ℃后，果膠酶活性會逐步降低[36]。周姝穎等[37]從酒曲中篩選出了一株低產果膠酯酶的解淀粉芽孢桿菌，接種此菌株制作強化酒曲，實驗組所得白酒中的甲醇含量顯著低于對照組，且接種量為3%時，甲醇含量最低，與對照組相比降低了66.03%。

1.8 脂肪酶

脂肪酶（EC3.1.1.3）屬于三酰基甘油酰水解酶類，能將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，具有廣泛的工業應用。大曲中的脂肪酶能將原料中的脂肪分解為脂肪酸、甘油、甘油單酯或者甘油二酯，同時分解脂肪所得的能量用于微生物的生長代謝，以上產物能合成豐富白酒風味的類脂[38]。脂肪酶逐漸被運用于白酒釀造副產物。顏晨鱗等[39]在黃水中添加食用酒精和脂肪酶，發現白酒風味酯的濃度增加了近32 倍。研究證明，此酶可重復使用，使得酯類轉化率保持不變。李站勝等[40]向白酒丟糟中加入脂肪酶，發現在20 %食用酒精（95 %vol）、1.5 %脂肪酶、20 ℃反應3 d 的條件下，實驗組的乙酸乙酯和己酸乙酯比對照組提高16.38 倍和16.67 倍；劉小敏[41]發現脂肪酶tabI 具有合成乳酸乙酯的能力，這為提高白酒中乳酸乙酯提供了可行方向。

2 大曲酶系的研究現狀

大曲一般采用開放環境自然發酵制得，品質受環境因素影響較大。在制作發酵劑時，大曲類似于培養基，接種的微生物來自環境，也來自于制作大曲的原料，發酵過程由經驗豐富的技術人員操作。因此，生產過程中存在部分不可預測和不可控的因素，造成了大曲乃至于白酒質量的不一致性，差異很大程度是大曲中菌系結構不同造成。細菌群落演替的關鍵因素是纖維素酶活性、酸度和水分含量等[42]，為更好地控制細菌群落組成提供了可能，從而有可能改善白酒的品質。

2.1 大曲酶系與菌系的研究

大曲酶系是由菌系分泌，有研究表明，在大曲發酵期，微生物數量在升溫期最高，高溫期下降，降溫期有所回升，大曲生物酶量也隨著這個規律變化[43]，大曲酶系與菌系息息相關，研究大曲酶系可從大曲菌系入手。大曲中菌類豐富，主要含有細菌、霉菌、酵母菌、放線菌等[1]，張崇軍等[44]從濃香包包曲中篩選出產蛋白酶活力高達86.5 U/g 的地衣芽孢桿菌（WLYQ-1.4）；唐賢華等[45]優化了濃香包包曲中耐性益生芽孢桿菌（WLYQ-1），使其高產蛋白酶，在最優條件下產蛋白酶活為87.56 U/mL；馬文瑞等[46]從藏曲中分離出的微生物，根霉M12 糖化能力最高，為（1382±77.38）μg/g·min，芽孢桿菌Q4蛋白酶活性最高，為（1035.56±40.09）μg/g·min。將高產蛋白酶菌應用到實際生產中能更好地豐富白酒的風味物質。

黃曉寧等[47]在大曲中篩選乳酸菌時，發現90%所篩乳酸菌株產α-淀粉酶，超過60 %的乳酸菌株產酯酶，且比起單一乳酸菌，在復雜發酵中，經過微生物之間復雜相互作用后的乳酸菌（E48）產酯酶能力最強，酯酶活性高達（63.4±0.4）U/mL。作為白酒發酵過程中的優勢菌，乳酸菌通過產生酯酶和代謝產物影響白酒的風味[48]。雷學俊等[49]從包包曲制曲過程中分離出9 個霉菌屬，曲中霉菌屬豐富。據研究，曲中糖化力主要來自于霉菌如根霉、黑曲霉、紅曲酶等。劉延波等[50]從賒店老酒大曲篩選出的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）高產淀粉酶，經過優化后，產酶活力高達（164.37±3.25）U/mL。可將高產酶微生物用于制造強化大曲，提高發酵效率。

2.2 大曲酶系與理化性質的研究

大曲菌系雖能分泌酶系影響物系的理化性質，物系的理化性質也能反過來影響菌系、酶系。將制曲過程中濃香型包包曲曲心、曲皮的總酸、水分等理化性質與曲皮、曲心微生物群落結構的研究結合分析，發現理化性質是影響包包曲微生物的重要因素，造成了曲中微生物數量和分布差異[51]，酶系分布與數量也會因為菌系變化發生改變。水分作為大曲理化性質之一，向來是研究大曲時不可忽視的，大曲中微生物生命活動與諸多酶反應都需要水，張宗舟[52]發現黑曲霉ZM-8 大曲的含水量會對酶系酶活產生影響，且控制含水量為49%～50%，室溫為25℃，培養40 h，酶系酶活顯著增大，這表示曲中水分變化會影響酶系的變化，具體機理有待研究。大曲總酸變化會引起pH 值變化，微生物及其數量種類受pH 值變化影響，其分泌的酶系也隨之改變。

2.3 大曲酶系在曲塊中的分布

大曲中的酶系來源于微生物群落代謝，微生物群落生長繁殖取決于曲塊通氣情況、溫度、水分等理化因素，所以研究大曲酶系的分布情況要從理化性質入手。研究大曲不同部位酶系的動態變化，發現在發酵過程中曲外層菌系數量高于曲心[53]，比起曲心，曲皮接觸了更多的氧氣，更有利于微生物群落生長，所以曲心酶活力一般都低于曲皮酶活力。大曲發酵初期，溫度從20 ℃逐漸上升到40 ℃，這一溫度范圍有利于微生物群落生長繁殖，酶系隨著微生物大量生長而被分泌，曲塊中總酶活達到最大。進入高溫期，微生物大量死亡，曲塊中的酶活力急劇下降。研究表明，十月制作大曲的酶活普遍高于六月制作的大曲[54]，造成這一差異的原因是六月環境溫度高，使得發酵大曲升溫過快，曲塊內微生物生長不充分，產酶也不充分。

2.4 大曲酶系的提取與測定

大曲酶活測定前處理步驟——大曲酶蛋白提取的成功與否決定后續酶活力檢測的最終結果，對大曲中胞外酶蛋白提取條件[55]進行研究，發現料液比對酶蛋白提取更加重要，提取時間達到1 h 后再增加對酶蛋白提取影響甚微，還發現曲中纖維素酶主要來自孢子休眠體的微生物，除了纖維素酶在提取時需要對水浸液進行超聲波粉碎，糖化酶等胞外酶[56]大多不需要進行特別處理，在適宜pH 值水溶液浸提即可。范偉業等[57]用tris-HCL 提取包包曲中的酶蛋白，發現在pH7、浸提2 h、料液比為1∶5 的條件下，提取酶蛋白效果最好，蛋白濃度為285.68 μg/mL，經過兩次離心得到粗酶液，能檢測出大曲中多種酶活。王玉霞等[58]用pH4.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液在4 ℃條件下過夜浸提大曲粉，料液比為1∶2，最后將浸提液過濾、離心得到粗酶液，所得粗酶液能檢測出α-淀粉酶、丹寧酶、木聚糖酶和脂肪酶酶活力。

在對大曲酶系的研究中，最直接的就是測定酶系酶活，找出最優酶活檢測方法測定各類酶活至關重要。劉璐[59]使用傳統比色法和分光光度法測定大曲液化酶活力，結果表明，不管是時間還是測定準確度，分光光度法都優于傳統比色法。除了分光光度法，有條件也可采取非常規檢測分析大曲酶系酶活力，張強等[60]利用HPLC 分析大曲中液化酶和糖化酶活力，發現與常規方法所測酶活力一致，酶聯免疫法也被用于大曲酯化酶活測定[61]，其準確性也可得到保障。為了使酶活測定更快捷，各類酶活測試盒被廣泛推廣，極大地提高了酶活測定效率。

3 展望

白酒大曲微生物群落演替的一般規律是目前白酒研究的熱點，大曲酶系與微生物群落、理化性質的關系密不可分，從酶系角度分析大曲發酵過程中影響其質量的因素，通過大曲菌系分泌的各種酶對各種類型大曲糖化發酵機理進行探究，有利于將大曲酶系進行利用，篩選出相關功能菌，為大曲發酵以及功能菌的應用提供理論基礎。期望未來能對大曲中如漆酶、植酸酶等少見酶類進行探究，進一步豐富酶系研究，找出白酒發酵中的關鍵酶，解析固態釀造原理。