響應曲面法優化黑皮雞樅液體配方研究

黃靜 李鵬 和耀威 劉忠玄 向準

摘要 ［目的］以貴州省生物研究所保藏的黑皮雞樅“HP1號”菌株為研究對象，研究不同營養物質對黑皮雞樅菌絲生長的影響。［方法］采用單因素試驗和響應曲面法試驗對黑皮雞樅的營養需求進行優化。［結果］黑皮雞樅最佳碳源為玉米粉，最佳氮源為酵母膏，維生素B1最適含量為10.0 mg/L。［結論］適宜黑皮雞樅液體培養的最佳配方為玉米粉24.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，維生素B1 10.0 mg/L。

關鍵詞 黑皮雞樅；生物量；響應曲面法

中圖分類號 S646? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）13-0049-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.012

Study on Optimization of Liquid Formula of Oudemansiella Radicata by Response Surface Method

HUANG Jing， LI Peng，HE Yao-wei et al

（Guizhou Institute of Biology，Guiyang，Guizhou? 550009）

Abstract ［Objective］The effect of different nutrients on the mycelial growth of O.radicata was studied with the strain ‘HP1 of O.radicata preserved in Guizhou Institute of Biology. ［Method］The single factor test and response surface methodology were used to optimize the nutritional requirements of O.radicata.［Result］The optimum carbon source of O.radicata was corn meal， the optimum nitrogen source was yeast extract， and the optimum content of vitamin B1 was 10.0 mg/L. ［Conclusion］The optimum formula suitable for the liquid culture of O.radicata was corn meal 24.0 g/L， yeast extract 5.0 g/L， potassium dihydrogen phosphate 2.0 g/L， magnesium sulfate 1.0 g/L， vitamin B1 10.0 mg/L.

Key words O. radicata;Biomass;Response surface method

基金項目 貴州省食用菌現代農業產業技術體系建設（GZCYTX2023-03）。

作者簡介 黃靜（1993—），女，貴州遵義人，研究實習員，碩士，從事食用菌栽培與病蟲害防控研究。通信作者，副研究員，碩士，從事食用菌栽培示范推廣研究。

收稿日期 2022-11-29

黑皮雞樅（O.radicata sensu Horak；Fide Segedin & P ennycook）屬于白蘑科小奧德蘑屬，又名長根奧德蘑、長根金錢菌、長根菇、長壽菇等［1-2］，是新近商業化栽培的熱點食用菌之一。黑皮雞樅香味馥郁，肉質鮮美，富含氨基酸、多糖、礦物質元素及蛋白質等多種營養成分［3］，具有較高的藥用價值，具有健脾益氣、降血壓、抑制腫瘤等功效［4-5］，是一種珍稀食藥用菌。黑皮雞樅屬中高溫型真菌，主要分布在亞熱帶與北溫帶地區［6］。黑皮雞樅在2006年實現人工栽培［7］，經過不斷優化菌種技術及栽培技術，已初步實現規模化栽培［8］。由于我國黑皮雞樅栽培歷史相對較短，菌種配方不穩定，菌種活力弱，導致規模化生產可重復性差、病蟲害嚴重、產量低等問題［9-10］。因此，筆者通過在前期對黑皮雞樅液體培養基單因素優化的基礎上，進一步明確培養基中的碳源、氮源和維生素的含量；通過響應曲面優化設計試驗研究各成分之間的相互作用，從而獲得最佳的液體培養基配方，旨在為黑皮雞樅的規模化生產提供優質菌種的同時，也為黑皮雞樅的品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株黑皮雞樅“HP1號”由貴州省生物研究所提供。

馬鈴薯綜合培養基：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，維生素B1 10.0 mg，瓊脂粉20.0 g，水1 000 mL。

供試培養基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養條件。

1 000 mL搖瓶裝液量400 mL，振蕩培養箱轉速165 r/min，培養溫度25 ℃，培養周期8 d。

1.2.2 生物量測定。

選擇過濾網抽濾去掉培養液，用蒸餾水清洗菌絲體表面并濾掉洗液，重復4～6次，洗凈的菌絲體用烘箱60 ℃烘干至恒重，稱重［11］。

1.2.3 單因素試驗。

①碳源對黑皮雞樅菌絲生長的影響。選用玉米粉、蔗糖、紅糖、果糖、小麥粉、可溶性淀粉、D-木糖7種物質為碳源，按配比加入培養基，以葡萄糖為對照，制作液體培養基，在0.12 MPa、121 ℃下滅菌30 min。3次重復。②氮源對黑皮雞樅菌絲生長的影響。選用黃豆粉、麥麩、牛肉膏、谷氨酸、酵母膏、豆粕粉6種物質為氮源，按配比加入培養基，以蛋白胨為對照，制作液體培養基，在0.12 MPa、121 ℃下滅菌30 min。3次重復，測定菌絲生物量。③生長因子維生素B1對黑皮雞樅菌絲生長的影響。以葡萄糖20.0 g、蛋白胨3.0 g、KH2PO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、水1 000 mL作為該試驗的基礎培養基，分別添加不同含量的維生素B1，測定其菌絲生物量。

1.2.4 響應曲面法優化。

利用響應曲面法優化［12-13］（表1），在上述單因素試驗基礎上，分別選取碳源（A）、氮源（B）和維生素B1（C）3個因子為試驗對象，在單因素試驗的基礎上，以玉米粉作為碳源、酵母膏作為氮源、維生素B1作為生長因子，菌絲體干重為響應值，采用響應曲面法確定黑皮雞樅液體培養的最佳營養條件。

1.3 數據統計與分析

試驗數據均利用 SPSS Statistics 18和design-expert 8.0.6進行統計分析（P<0.05），并利用軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同碳源對黑皮雞樅菌絲量的影響。

由表2可知，7種碳源中，黑皮雞樅菌絲對玉米粉的利用最好，菌絲干重達8.67 g/L，菌絲萌發最快，菌球直徑為3～5 mm，密度大且菌液澄清；其次是小麥粉和蔗糖，菌絲萌發較快，菌球直徑為4～8 mm、密度中等，以小麥粉為碳源時，菌液有點渾濁；對葡萄糖、蔗糖等其他碳源的利用相對較差。菌絲萌發時間稍長，菌球大、密度低。說明黑皮雞樅菌絲生長的最適碳源為玉米粉。

2.1.2 不同氮源對黑皮雞樅菌絲生物量的影響。

由表3可知，在所選氮源中，黑皮雞樅菌絲對酵母膏的利用率最高，菌絲干重達8.75 g/L，菌絲萌發最快，菌球直徑為4～6 mm，大小均勻，密度高；其次麥麩、豆粕粉、蛋白胨，菌球大小比較均勻、密度中等；對谷氨酸的利用最差，菌絲萌發需要時間最長，生成的菌球偏大、不均勻且密度低。綜上所述，黑皮雞樅菌絲生長的最適氮源為酵母膏。

2.1.3 不同維生素B1含量對黑皮雞樅菌絲生物量的影響。

由圖1可知，維生素B1對黑皮雞樅菌絲的生長沒有決定性的營養作用，但適當添加維生素B1，可在一定程度上促進菌絲的生長，當維生素B1在培養基中含量增加到10.0 mg/L時，菌絲干重達到最高為9.3 g/L；菌絲萌發較快，菌球中等，大小較均勻，菌液清澈，密度中等；當維生素B1在培養基中的含量增加到15.0 mg/L時，菌絲干重開始緩慢下降為8.63 g/L。因此，確定維生素B1的含量為10.0 mg/L。

2.2 響應面優化試驗結果

由表4可知，以A、B和C為響應變量，以Y值為響應值對表4數據進行處理，得到表5方差分析表，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次多項式擬合，得到預測模型：

R1=+11.31+0.88A+0.33B-0.25C+0.92AB-0.39AC+0.15BC-1.11A2-1.10B2+0.64C2

表5結果表明，A-A、B-B、AB、A2、C2和B2項差異極顯著，C-C和AC項差異顯著，BC項差異不顯著。模型P值<0.000 1，可信度水平大于99.99%，說明該模型有意義，所擬合的回歸方程合適。復相關系數R2=0.986 1，表明相關性好，該模型失擬值P值0.395 8>0.05，失擬值不顯著，說明試驗可信。另外從F值可以看出，3個因素對菌絲生物轉化率的影響順序為A>B>C，即玉米粉>酵母膏>維生素B1。

利用回歸方程分析黑皮雞樅菌絲的干重和各因素變化的響應曲面圖。由響應曲面圖可知，玉米粉、酵母膏和維生素B1各因素對菌絲干重的影響。每個響應面表示2個獨立因素之間的交互作用，另一個因素保持在0水平編碼。

玉米粉質量濃度與酵母膏質量濃度兩因素的交互作用極顯著，在酵母膏質量濃度較高時，隨著玉米粉質量濃度升高，黑皮雞樅菌絲干重迅速上升至平緩，隨后下降；在酵母膏質量濃度較低時，隨著玉米粉質量濃度升高，黑皮雞樅的菌絲干重緩慢上升至平穩，隨后下降；在玉米粉質量濃度較高時，隨著酵母膏質量濃度上升，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平穩，隨后下降；在玉米粉質量濃度較低時，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平穩，隨后略有下降（圖2）。

玉米粉質量濃度與維生素B1含量兩因素的交互作用極顯著，在維生素B1含量較低時，隨著玉米粉質量濃度升高，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平緩，隨后略有下降；在維生素B1含量較高時，隨著玉米粉質量濃度升高，黑皮雞樅菌絲干重緩慢上升至平緩，隨后迅速下降；在玉米粉質量濃度較低時，隨著維生素B1含量升高，黑皮雞樅菌絲干重均緩慢上升；在玉米粉質量濃度較高時，隨著維生素B1含量升高，黑皮雞樅菌絲干重呈緩慢下降趨勢（圖3）。

3 結論與討論

黑皮雞樅是一種含有豐富營養價值的食用菌，是近年來比較熱門、栽培前景廣的商業化栽培食用菌。在西南地區有小規模栽培，存在產量少、質量不穩定、人工成本高等問題，遠不能滿足當地市場的需求。其中菌種是制約黑皮雞樅產業發展的因素之一。

該研究以菌株HP1為試驗材料，對其營養需求進行研究，將所得數據通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得出，影響黑皮雞樅菌絲生長最佳碳源為玉米粉23.82 g/L，最佳氮源為酵母膏5.22 g/L，最佳維生素B1 10.46 mg/L，為方便試驗將優化后的配方調整，得出最優配方為玉米粉24.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，維生素B1 10.0 mg/L。此營養條件下，黑皮雞樅菌絲體的干重（理論）為11.40 g/L。在此培養條件下進行3次平行重復試驗驗證，均值為11.39 g/L。與最優值相近，進而說明模型的可靠性良好，擬合度良好。相比現有報道，該研究所得黑皮雞樅菌絲生物轉化率較高，菌絲球小、密度大且大小均勻，同時生產工藝簡單且成本低、重復性強，非常適用于黑皮雞樅的栽培前期準備，提升菌種穩定性和增強抗逆性等，也為黑皮雞樅高產穩產奠定了基礎。

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