瑞替加濱對左旋布比卡因引起的中樞神經系統毒性的影響

苑進革,王志剛,王新波,程艷新,陳永學

(1.邯鄲市中心醫院麻醉科,邯鄲 056008;2.河北醫科大學第三醫院疼痛科,石家莊 050000)

中樞神經系統(CNS)的興奮是局部麻醉藥的副作用之一。局部麻醉藥引起的中樞神經系統興奮的機制,可能與選擇性抑制皮質突觸有關。電壓門控鈉通道在動作電位的產生中起關鍵作用,電壓門控鈉通道主要參與中樞神經毒性,而局麻藥的作用通常與其抑制鈉通道有關[1]。然而,多項研究表明,布比卡因也可以通過不同的阻斷機制阻斷K+通道。電壓依賴性K+通道如Kv1.1、KCNQ2/3、HERG、KATP、K2P通道在不同細胞中均能被布比卡因阻斷[2]。KCNQ2/Q3通道是一種具有電壓依賴性、慢激活、非失活、慢去活的外向、延遲整流型鉀離子通道,通過外向鉀離子電流維持著神經細胞膜的穩定性、避免神經細胞的過度興奮[3]。先天性或藥物引起該通道功能障礙,可引起驚厥等臨床癥狀。布比卡因可以改變KCNQ2/3鉀離子通道電壓感知激活域附近的局部場電位,從而介導濃度依賴性和非立體選擇性的可逆阻滯,可能是引起神經毒性驚厥等癥狀的重要機制。所以激活KCNQ2/Q3通道可能是治療局麻藥神經毒性所致驚厥的重要策略。

瑞替加濱(retigabine,RTG)是第一個被批準用作臨床抗癲癇藥物的電壓門控K+通道激活劑,瑞替加濱能夠有效逆轉其對KCNQ2/3鉀離子通道抑制作用[4],大量研究表明,瑞替加濱可有效降低多種動物模型的驚厥發作活動和難治性患者的驚厥發作頻率[5]。然而,目前關于其對局麻藥所致驚厥作用的動物體內研究尚鮮見報道。為此,以家兔作為研究對象,靜脈注射左旋布比卡因以產生驚厥作為模型,觀察應用瑞替加濱后家兔的腦電圖和行為性驚厥的影響,確定KCNQ2/3通道在左布比卡因誘導的中樞神經系統毒性中發揮的作用,以及瑞替加濱對局部麻醉藥引起的中樞神經毒性的有效性,從而對臨床中局麻藥中樞神經毒性癥狀的治療提供借鑒。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

雌性新西蘭家兔20只,4～5月齡,體重2.5～3.1 kg,購自河北醫科大學動物實驗中心,動物合格證號:SCXK(冀)2015-0048。維持動物飼養環境清潔衛生,使環境的溫度保持在(22±3) ℃,每日家兔接受12 h光照,晝夜循環(光照時間每日6:00—18:00),相對濕度40%～60%。進食水自由,每日對飼養環境進行清潔打掃,家兔墊料保持干燥。為避免環境影響,適應一周后開始實驗。所有動物實驗過程均按照中國實驗動物操作規范進行操作。隨機分為以下兩組:瑞替加濱組(R組,樣本數n=10)和對照組(C組,樣本數n=10)。

1.2 試劑與儀器

鹽酸左旋布比卡因(潤度制藥有限公司),瑞替加濱(HPLC-DAD純度為>99%,臺州新辰化工有限公司),NicoletOne腦電圖設備(MFI Medical Equipment,Inc.,USA),GE Dash5000心電監護儀(美國),醫用15 mm細針。

1.3 實驗方法

實驗均在14:00—17:00進行。將意識清醒的家兔俯臥于平臺上,不加約束。在兔耳緣靜脈進行穿刺并置入導管,在4～5 mL 0.1%左布比卡因浸潤麻醉下,將電極針固定在兔頭皮左右額葉、太陽穴、頂葉、枕葉,并在左右耳放置參考電極。用剪刀去除胸部及四肢兔毛,貼上電極片,采集V1導聯的心電信號,心電圖機的定準電壓調為20 mm/mV,走紙速度為50 mm/s,記錄心電圖。待兔靜置約5 min后,連接靜脈留置導管,調整輸注泵并以40 mg/kg/h持續輸注0.5%左旋布比卡因,直到家兔行為性驚厥發作,停止輸注。瑞替加濱組(R組)通過導管一次性注射瑞替加濱5 mg/kg(用1 mg/kg生理鹽水溶解)消除驚厥,對照組(C組)注射1 mL/kg生理鹽水作為對照。

1.4 觀察指標

記錄兩組新西蘭家兔發生驚厥時輸注左旋布比卡因時間;驚厥行為以及驚厥腦電波持續時間;同時記錄兩組新西蘭家兔基礎心率、驚厥前以及給予瑞替加濱和生理鹽水處理后30 min心率變化。在驚厥行為發生后至20 min持續監測并記錄兔的腦電圖(EEG),并進行定量腦電圖(QEEG)分析,使用NicoletOne5.7.5(VIASYS HealthCare Inc.USA)計算分析額葉β(13.0～30.0 Hz)、θ(4.0～7.8 Hz)頻段腦電功率譜分析。腦電圖和行為性驚厥都是由對注射試劑不知情的技術人員觀察。

1.5 統計學分析

由于研究目的是觀察瑞替加濱在消除驚厥發作方面的影響,因此對每組前三只兔子的平均癲癇發作持續時間±標準差(mean±SD)作為計算所需樣本量的參數。在初步研究中,研究組和對照組的腦電圖發作平均持續時間±SD分別為(29±15) s和(240±50) s。在顯著性和功率分別設為0.05和80%的情況下,每組所需樣本量為6只,為了增強數據的可信度我們每組的樣本量選擇為10只。采用GraphPad Prism6.0軟件,正態分布計量資料以平均數±標準差(x±s)表示,組內比較采用重復測量方差分析,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兔子一般情況比較

兩組兔子月齡、體重、心率并無明顯差異(P>0.05)。試驗期間未發生動物死亡或心臟衰竭。表1為兩組兔一般情況及初始心率比較。

表1 兩組兔一般情況及初始心率比較Table 1 Comparison of general condition and initial heart rate of rabbits in the two groups

2.2 兩組兔發生驚厥持續時間以及左旋布比卡因輸注時間比較

兩組兔驚厥發生時輸注左旋布比卡因藥量無差異(P>0.05);與C組比較,R組的家兔行為學驚厥持續時間明顯縮短(P<0.01),腦電波(EEG)驚厥持續時間明顯縮短(P<0.01),如表2所示。

表2 兩組兔發生驚厥局麻藥用量、行為和腦電圖驚厥時間比較Table 2 Comparison of local anesthetic dosage,behavior and EEG seizure time in the two groups of rabbits

驚厥行為指四肢抽動、軀體背曲強直等全身痙攣性;驚厥腦電波其特征是多發性尖峰和慢波復合,如圖1所示。

圖1 兔驚厥過程腦電波波形圖Fig.1 Eeg waveform of rabbit during convulsion

2.3 兩組兔驚厥發生前心率變化比較

兩組兔0 min至驚厥(S)發生心率比較無顯著差異(P>0.05);與0 min時心率相比,兩組兔3 min至驚厥(S)發生,心率顯著降低(P<0.05),如表3所示。

表3 兩組動物輸注左旋布比卡因至驚厥心率比較Table 3 Comparison of heart rates between the two groups of animals infused with levobupivacaine until convulsion

2.4 兩組兔驚厥發生后心率變化比較

與驚厥(S)發生時比較,C組在1 min,R組在1～30 min心率顯著上升(P<0.05);與C組比較,R組在5～30 min心率明顯高與C組(P<0.05),如表4所示。

表4 兩組動物在驚厥發生后360 min心率比較Table 4 Comparison of heart rate between the two groups of animals 30 min after the onset of convulsion

2.5 兩組家兔定量腦電圖(QEEG)β和θ波頻段腦電功率譜分析結果比較

與基礎值比較,C組、R組發生驚厥時β和θ波功率均明顯升高(P<0.05),驚厥發生后1～20 minβ和θ波功率均較基礎值明顯升高(P<0.05)。與驚厥時比較,C組β和θ波功率在1 min、2 min時顯著升高(P<0.05),5～20 min又顯著降低(P<0.05);R組β和θ波功率在驚厥后1～20 min功率均顯著下降(P<0.05)。與C組比較,R組β波功率在驚厥后1～15 min、θ波功率在1～10 min顯著降低(P<0.05),如表5所示。

表5 兩組家兔額葉腦電圖β和θ波頻段腦電功率譜分析Table 5 EEG power spectrum analysis of frontal EEG in the β and θ band in the two groups of rabbits

3 討論

布比卡因作為一種局部麻醉劑在臨床上廣泛應用,左旋布比卡因是布比卡因異構體,其藥理成分比布比卡因更為安全。左旋布比卡因表現出與布比卡因類似的阻斷KCNQ2/3通道的潛力,但具有較低的心臟毒性[6-7],所以選擇左旋布比卡因來避免家兔的嚴重的心臟毒性。全身麻醉藥可影響局麻藥的中樞毒性反應,并且影響腦電波的觀察,以清醒家兔為對象避免了全身麻醉用藥的影響。在實驗中我們以低濃度左旋布比卡因浸潤麻醉,將電極針固定,避免了對家兔的疼痛刺激損傷。如圖1所示,驚厥發作前家兔均處于平靜,腦電圖以β波為主。快速、低振幅的β波帶被認為是大腦清醒皮層中最重要的腦電圖標記,它能夠形成意識和記憶。由于臨床麻醉中,局麻藥中樞毒性表現主要發生在有意識的區域麻醉患者,所以該實驗以清醒家兔制備的動物模型符合研究局麻藥誘導的中樞神經系統毒性。家兔腦與人腦有許多相同之處,且家兔較為溫順、頭顱較大,可同時安放多個電極,是進行腦電圖研究的理想實驗動物[8]。

驚厥發作是神經元異常放電、興奮和抑制性失衡的結果。離子通道由于受到干擾造成結構或功能改變,就會產生神經元出現異常放電,從而導致驚厥。離子通道包括電壓門控離子通道和配體門控通道,其表達異常影響神經元的興奮性。與驚厥相關的離子通道包括電壓門控鈉、鉀、鈣通道,鉀離子通道是目前驚厥治療領域研究最多見的一類離子通道,包括ERG、KV2、KCN、EAG等[9]。KCNQ(Kv7)是電壓門控鉀離子通道(voltage-gated potassium channels,Kv)中的重要一員,包括5個亞型,分別是KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5,不同亞型的KCNQ在組織分布、生理、病理功能特點上存在著顯著的差異,其中KCNQ2、KCNQ3廣泛表達于中樞神經系統中,KCNQ2、KCNQ3異聚體通道是介導M電流的主要分子基礎,因此KCNO2/KCNO3通道也稱為M通道[10]。Yang等[4]研究發現,長效酰胺類局部麻醉藥均可抑制KCNQ2/Q3通道,造成神經節細胞興奮性的易化。臨床麻醉中局部麻醉藥中毒時出現患者出現的抽搐等不良癥狀與動物實驗中阻滯KCNQ2/Q3通道出現的癥狀相似。這表明局部麻醉藥的中樞神經毒性作用可能與其抑制KCNQ2/Q3通道有關。

局麻藥作用的主要機制是抑制電壓門控鈉(NaV)通道,但這種抑制能否解釋藥物的全身毒性作用,包括初始的中樞神經系統興奮和驚厥作用,尚不確定[11]。研究表明,長效局麻藥阻斷KCNQ2/3鉀離子通道以及由此引起的神經細胞興奮性增高[12],所以KCNQ2/3鉀離子通道抑制可能是布比卡因/左旋布比卡因誘導中樞神經系統毒性的原因。瑞替加濱(retigabine,RTG)是一類研究最為廣泛KCNQ通道開放劑,瑞替加濱(RGB)是首個用于治療驚厥的M型鉀離子通道開放劑,2011年獲美國食品和藥物管理局批準,其關鍵作用靶點是使腦部KCNQ2/3鉀通道電流增強,降低神經興奮性,最終呈現出抗癲癇效應瑞。瑞替加濱通過重新打開被局麻藥關閉的KCNQ2/3鉀離子通道來減少神經興奮,因此為局麻藥引起的驚厥的治療提供了一種新的治療方法。鎮靜劑如巴比妥類藥物、苯二氮卓類藥物和異丙酚已被有效用于預防和治療局部麻醉性中樞神經系統中毒。它們都是A型-氨基丁酸受體(GABA-A)激動劑,其作用導致Cl電流增強,從而降低靜息膜電位,這一機制可能被GABA-A激動劑用于逆轉局部麻醉藥引起的中樞神經系統過度興奮[13-14]。與巴比妥類藥物或苯二氮卓類藥物相比,瑞替加濱不會引起呼吸抑制。并且在研究中發現,注射瑞替加濱后沒有出現家兔呼吸抑制的現象,但并未對其呼吸數據做統計比較。

為了監測瑞替加濱對腦電活動的影響,對家兔腦電圖進行了連續腦電圖監測,并進了定量腦電圖(QEEG)分析。定量腦電圖和臨床常用的其他腦電參數相比,充分保留了腦電圖的全面的信息,數據的誤差小。β波頻率與驚厥狀態有很好的相關性,可以作為驚厥時腦電波的主要觀察指標。在正常清醒家兔腦電圖額區和顳區以θ波為主(約占50%),而頂、枕區則以β波為主(占40%～50%),這表明活躍的皮層神經元被功能腦干網狀激活系統產生的神經調節劑(主要是乙酰膽堿和去甲腎上腺素)去極化。伴隨著行為性癲癇發作,兔表現出典型的癲癇性腦電圖,其特征是高頻和高振幅波[8,15]。研究發現,注射左旋布比卡因至驚厥發生后,腦電圖示β波和θ波功率顯著升高,表明驚厥腦電圖發生。同時觀察注射瑞替加濱1 min后,β波和θ波功率顯著下降,而注射生理鹽水的家兔β波和θ波功率5 min后才有所下降,并且功率在β波在20 min、θ波15 min時與注射瑞替加濱的家兔功率一致,表明瑞替加濱能有效的終止左旋布比卡因中樞神經毒性導致的行為性和腦電波驚厥。腦電波的改變表明瑞替加濱通過減少神經興奮而消除驚厥發作。

KCNQ2/3鉀離子通道在心肌細胞中不表達,瑞替加濱不直接影響心功能。左旋布比卡因能顯著降低家兔心率,驚厥發生后停止左旋布比卡因輸注并給予瑞替加濱后,兔的心率明顯升高。雖然給予生理鹽水的兔心率也有一定升高,但心率明顯低于瑞替加濱組,其具體機制尚未了解,還有待進一步研究。

4 結論

KCNQ2/3通道在左旋布比卡因誘導的中樞神經系統毒性中發揮作用;KCNQ2/3鉀通道激活劑瑞替加濱能有效地消除左旋布比卡因引起的兔腦電圖驚厥波和行為驚厥。