2個豬籠草品種耐冷性比較研究

阮繼偉，楊春梅，余蓉培，瞿素萍，單芹麗,2，金春蓮， 吳麗芳*

（1.云南省農業科學院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術研究中心，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604）

豬籠草(Nepenthaceae)現已成為引人注目的觀賞植物，其由葉片變化而來的籠狀變態葉造型獨特，同時具有食蟲特性，是目前食蟲植物中最受人們青睞的種類之一。近年來，云南從美國獨家授權引入了一批豬籠草新品種Brice［Nepenthes.Khasiana×(ventricosa×maxima)］，系葫蘆豬籠草(Nepenthes ventricosa)、大豬籠草(Nepenthes maxima)和卡西豬籠草(Nepenthes Khasiana)的雜交品種，其籠狀變態葉較大、顏色豐富、觀賞性更佳，但在滇中地區栽培冬天易發生冷害。從福建引入的毛豬籠草(Nepenthes. fusca×maxima)，系暗色豬籠草(Nepenthes fusca)和大豬籠草(Nepenthes maxima)的雜交品種，在國內栽培較多，在滇中地區栽培表現出一定的耐冷性。為了促進豬籠草新品種在生產上的推廣應用，有必要針對新品種開展耐冷性的評價研究，以便為實際生產提供指導。劉學慶等［1-4］研究認為，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量等可作為花卉等植物耐冷性強弱的判斷依據。有關豬籠草發生冷害的下限溫度未見報道，因此本研究針對耐冷性表現差異的Brice和毛豬籠草2個品種，利用夏季養護在大棚內的植株作為試驗材料，在不同溫度（15/0、15/2和25 ℃/15 ℃）處理下，調查2個品種植株的冷害發生癥狀及耐冷相關指標，并明確2個豬籠草品種耐冷性差異以及冷害發生的溫度點和時間點，闡述耐冷相關指標（活性）的變化規律，以期為生產中變溫調控提供理論指導，并為需要精確時間點取樣的代謝和分子試驗提供取樣時間點依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從美國引入的Brice和從福建引入的毛豬籠草，于2020年4月按常規栽培技術種植于云南省玉溪市江川區九溪鎮的云南農業科技園內(24°18′N，海拔1760 m)。

1.2 試驗設計

夏季棚內種植的豬籠草植株于2021年6月26日晚放入光照培養箱，在光照/黑暗時間為12 h/12 h條件下設置不同的溫度處理，即T1(15 ℃/0 ℃)、T2（15 ℃/2 ℃）、T3（25 ℃/15 ℃）。以T1為例，光照時溫度為15 ℃，黑暗時溫度為0 ℃。每天在暗處理結束后2 h內（8:00～10:00），連續8 d，分別對2個品種植株進行葉片取樣0.2 g，用于測定可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛(MAD)含量，以及過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，并對其變化趨勢進行分析。

分別按上海優選生物科技有限公司的植物可溶性糖試劑盒說明書（微量法）、CA法蛋白含量測定試劑盒說明書（微量法）、過氧化氫酶活性檢測試劑盒說明書（微量法）、過氧化物酶活性檢測試劑盒說明書（微量法）、超氧化物歧化酶試劑盒說明書（微量法）、丙二醛含量試劑盒說明書（微量法）測定和計算各耐冷指標的含量與活性。

1.3 試驗方法

2020年4月16日將豬籠草品種Brice和毛豬籠草各100株小缽（直徑55 mm、高55 mm)苗種植于12 cm×12 cm營養缽內，缽內填充栽培基質，按泥炭∶紅土=8∶2(v/v)的比例混合。植株按常規栽培技術養護于塑料大棚內。冬季夜間最低溫小于10℃后，日落前關閉大棚頂膜、側膜及盆內遮陽網保溫，日出后首先打開遮陽網，棚內溫度高于25 ℃后再打開大棚頂膜、側膜。2020年越冬后，存活的植株正常管理（植株放入培養箱前1周的棚內氣溫在20～32 ℃之間），于6月26日晚20:00放入不同溫度的光照培養箱（恒宇HGZ-H400，上海躍進醫療器械有限公司）內，設置20:00至次日8:00無光照，8:00～20:00有光照（12000 lx)。本試驗的3個處理均包括毛豬籠草5株、Brice 4株。取樣時間為6月27日—7月4日。期間適時給基質補水，以保證植株水分充足；觀察各處理植株冷害發生情況并記錄拍照。T1、T2和T3處理的日平均溫度分別為7.5、8.5和20.0 ℃，處理前1周大棚內的平均溫度為25.6 ℃。

1.4 數據處理

觀察記錄的原始數據采用Excel 2007軟件進行處理，用SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 植株冷害表現

由圖1可以看出：T1溫度條件下，處理2 d后（6月28日上午9:00），Brice的葉片已經出現了明顯的冷害，而毛豬籠草的葉片沒有出現冷害。

圖1 豬籠草2個品種在低溫處理2 d后的植株凍害情況

由圖2可知：低溫處理5 d后（7月1日），對于耐寒品種毛豬籠草，夜溫在T1、T2、T3溫度條件下，A1、A2、A3處理的植株均沒有表現出明顯的冷害。而對于Brice而言，在T1溫度條件下，B1處理的4株植株全部發生了嚴重的冷害；在T2溫度條件下，B2處理的4株植株中有2株發生了冷害；在T3溫度條件下，B3處理的植株均未發生任何冷害。

圖2 豬籠草2個品種在低溫處理5 d后的植株凍害情況

由圖3可知：低溫處理18 d后（7月14日），對于耐寒品種毛豬籠草，在T1和T2溫度條件下，A1、A2處理的植株均表現出老葉有冷害，但植株仍存活；在T3溫度條件下，A3植株沒有表現出明顯的冷害。而對于Brice而言，在T1溫度條件下，B1處理的4株植株全部因冷害死亡；在T2溫度條件下，B2處理的4株植株中有2株存活，但老葉已發生冷害；在T3溫度條件下，B3植株沒有表現出任何冷害。

圖3 豬籠草2個品種低溫處理18 d后的植株凍害情況

2.2 植株葉片組織耐冷性生化指標

2.2.1 可溶性糖含量分析 隨著低溫處理周期的增加，植株葉片中可溶性糖含量也在增加。在T2溫度處理下，毛豬籠草可溶性糖含量明顯增加(圖4A)，植株葉片中可溶性糖含量從7月27日(處理1 d)的31.18 mg/g增加到8月4日(處理8 d)的33.93 mg/g；Brice的含量也表現出同樣的增加趨勢(圖4B)，從7月27日（處理1 d)的29.22 mg/g增加到8月3日(處理7 d)）31.92 mg/g。由圖4可知，毛豬籠草在T1溫度處理4 d后（7月30日），植株葉片中可溶性糖含量明顯高于其他2個溫度處理(T2和T3）的；而Brice在T1溫度處理4 d后（7月30日），植株葉片中可溶性糖含量也明顯高于T2和T3處理的，但處理6 d后差異消失。在相同的取樣時間點，毛豬籠草植株葉片的可溶性糖含量顯著高于Brice的。

圖4 豬籠草2個品種低溫處理后葉片中可溶性糖含量變化情況

2.2.2 可溶性蛋白含量分析 從圖5可以看出，隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中可溶性蛋白含量逐漸降低，處理5 d后又逐漸上升。在T2溫度處理下，毛豬籠草的可溶性蛋白含量從7月27日(處理1 d)的24.01 mg/g降低到7月30日(處理4 d)的22.99 mg/g，再增加到8月4日(處理8 d)的24.97 mg/g(圖5A)；Brice也表現出同樣的增加趨勢(圖5B)，從7月27日(處理1 d)的22.27 mg/g降低到7月30日(處理4 d)的21.17 mg/g，再增加到8月4日(處理8 d)的23.52 mg/g。由圖5可知，毛豬籠草在各低溫條件下，植株葉片中可溶性蛋白含量無明顯差異，而Brice在T1溫度處理4 d后（7月30日），植株葉片中可溶性蛋白含量明顯低于T2和T3處理的。毛豬籠草植株葉片中可溶性蛋白含量整體高于Brice的。

圖5 豬籠草2個品種低溫處理后葉片中可溶性蛋白含量變化情況

2.2.3 過氧化氫酶活性分析 從圖6可以看出，隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中過氧化氫酶活性逐漸增加，在處理4 d后進入比較平穩的水平。在T2溫度處理下，毛豬籠草過氧化氫酶活性從7月27日(處理1 d)的9.58 U/mg上升到7月30日(處理4 d)的11.59 U/mg，之后進入平穩期(圖6A)；Brice也表現出同樣的增加趨勢(圖6B)，從7月27日(處理1 d)的9.25 U/mg上升到7月30日(處理4 d)的10.92 U/mg，之后進入平穩期。由圖6可知，毛豬籠草在T1溫度處理下，植株葉片中過氧化氫酶活性明顯低于T2和T3處理的，而Brice在T3溫度條件下，植株葉片中過氧化氫酶活性明顯高于T1和T2處理的。

圖6 豬籠草2個品種低溫處理后葉片中過氧化氫酶活性變化情況

2.2.4 過氧化物酶活性分析 從圖7可以看出，隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中過氧化物酶活性逐漸增加，并在處理4 d后達到比較平穩的水平。在T2溫度處理下，毛豬籠草過氧化氫酶活性從7月27日(處理1 d)的206.65 U/mg上升到7月30日(處理4 d)的246.31 U/mg，之后進入平穩期(圖7A)；Brice也表現出同樣的增加趨勢(圖7B)，從7月27日(處理1 d)的220.88 U/mg上升到7月30日（處理4 d)的262.40 U/mg，之后進入平穩期。由圖7可知，毛豬籠草在T1溫度處理下，植株葉片過氧化物酶活性明顯低于T2和T3處理的，而Brice在T3溫度處理下，植株葉片中過氧化氫酶活性明顯高于T1和T2處理的。Brice植株葉片中過氧化物酶活性整體高于毛豬籠草的。

圖7 豬籠草2個品種低溫處理后葉片中過氧化物酶活性變化情況

2.2.5 超氧化物歧化酶分析 由圖8可以看出，隨著低溫處理天數的增加，植株葉片超氧化物歧化酶活性逐漸增加，并在處理4 d后達到比較平穩的水平。在T2溫度處理下，毛豬籠草過氧化氫酶活性從7月27日(處理1 d)的1.03 U/mg上升到7月30日(處理4 d)的1.12 U/mg，之后進入平穩期(圖8A)；Brice也表現出同樣的增加趨勢(圖8B)，從7月27日(處理1 d)的1.06 U/mg上升到7月30日(處理4 d)的1.17 U/mg，之后進入平穩期(T1處理除外)。由圖8可知，Brice葉片組織超氧化物歧化酶活性整體高于毛豬籠草(T1處理除外)的。

圖8 豬籠草2個品種低溫處理后葉片中超氧化物歧化酶活性變化情況

2.2.6 丙二醛含量分析 從圖9可以看出，隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中丙二醛含量逐漸增加，其中處理前4 d的增加速率較后4 d的大。在T2溫度處理下，毛豬籠草丙二醛含量從7月27日(處理1 d)的1.06 nmol/mg上升到8月4日(處理8 d)的1.64 nmol/mg（圖9A)；Brice也表現出同樣的增加趨勢（圖9B)，從7月27日(處理1 d)的0.94 nmol/mg上升到8月4日(處理8 d)的1.44 nmol /mg。毛豬籠草植株葉片中丙二醛含量整體高于Brice的。

圖9 豬籠草2個品種低溫處理后葉片中丙二醛含量變化情況

3 討 論

本研究表明，毛豬籠草的耐冷性顯著高于Brice的。Brice在T1和T2處理2 d后，植株葉片均出現了冷害；處理5 d后，T1處理的4株植株全部死亡，T2處理的4株植株中有2株死亡。毛豬籠草在18 d后，T1和T2處理均在老葉上表現出冷害。冬季生產上為保障豬籠草植株不受冷害，對于耐寒品種毛豬籠草應保證大棚溫度短期（10 d）內不低于0℃，長期應保證溫度在2 ℃以上；對于不耐寒品種Brice，應保證大棚溫度高于2 ℃，否則4～5 d的夜間低溫就會有超過一半的植株發生冷害并死亡。

可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量均被報道過與植株耐冷性有關［1,3,5-6］。本研究表明，以上全部指標均隨著低溫處理天數的增加而發生了明顯變化。植物體內糖含量與抗性密切相關，羅婭［5］研究認為，低溫脅迫后草莓體內可溶性糖含量增加，從而減輕了脅迫對草莓造成的損傷。本試驗中，隨著低夜溫處理天數的增加，植株葉片中可溶性糖含量也在增加，其中毛豬籠草增加明顯，且增幅顯著高于Brice的，這在一定程度上可解釋毛豬籠草的耐冷性強于Brice的。

隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中可溶性蛋白含量逐漸降低，處理5 d后又逐漸上升。其中毛豬籠草可溶性蛋白含量顯著高于Brice的。可溶性蛋白質含量與植物的耐寒性存在密切關系，蛋白質含量的增加，有助于提高細胞內的束縛水含量，降低冰點，從而防止細胞內結冰、避免細胞冰凍死亡［7-9］。本研究中可溶性蛋白含量先降后升，說明植株遇冷后耐冷性下降，經過4 d調整后耐冷性逐漸恢復。毛豬籠草的可溶性蛋白含量顯著高于Brice的，這也解釋了毛豬籠草具有較好的耐冷性。

過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶是植物抗氧化酶的主要類別［11-12］。植物受到環境脅迫時會導致活性氧的積累，積累到一定程度植物會受到傷害。SOD是植物抗氧化酶系統的第一道防線，SOD活性升高，且維持較高的水平, 就能夠清除大部分的氧自由基, 減輕對細胞膜的傷害, 使植株具有較強耐受低溫的能力。本研究中，隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中SOD活性逐漸增加，在處理4 d后進入比較平穩的水平。不耐寒品種Brice在T1溫度條件下，SOD活性顯著低于其他溫度處理的，植株發生冷害的程度也更嚴重（甚至死亡）。POD可以催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應，清除由逆境和脅迫誘發的H2O2［13］。本研究中，隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中POD活性逐漸增加，在處理4 d后進入比較平穩的水平。CAT在清除植物體內的氧自由基時起著重要的作用［14］。本研究中，隨著低溫處理周期的增加，植株葉片中CAT活性逐漸增加，在處理4 d后進入比較平穩的水平。

隨著低溫處理天數的增加，植株葉片中MDA含量逐漸增加，其中前4個低溫周期的增加速率較后4個低溫周期的大，且與可溶性糖含量的變化趨勢一致，相關性較高。Janska等［14-15］研究表明，植物受到干旱或者低溫脅迫時，都會導致細胞內活性氧的增加。細胞膜系統在受到氧化傷害后會產生MDA，其含量可表征細胞膜脂過氧化的程度，也常用來表征細胞膜受破壞的程度。王冠群等［9］在針對鳶尾的耐寒性研究中發現，其MDA含量先上升后下降，說明葉片在適應低溫鍛煉通過內部代謝調整提高了耐寒性。本研究有限的取樣時期內未見MDA含量下降拐點的出現，這與萬玲等［2］的研究結論基本一致。

本研究中可溶性蛋白含量、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性變化趨勢均在低溫處理4 d后出現拐點，這說明豬籠草植株葉片組織在低溫處理下耐寒相關生理代謝調整的周期是4 d，這也可以解釋Brice在T2（夜溫2℃）處理下，5 d后沒有再出現新增死亡植株。這一時間點的明確有助于下一步精細化取樣分析研究代謝及分子水平的變化趨勢，也有助于明確生產中變溫處理的最低間隔時間，以便豬籠草植株有充足的調整適應時間。

本研究中，T3處理平均溫度較處理前（養護大棚內）僅降低了5.6℃，但葉片組織相關代謝物的變化趨勢與T1（降低18.1℃）和T2（降低17.1℃）處理的一致，而且數值也比較接近，說明豬籠草植株在養護的過程中，只要平均溫度下降超過5.6 ℃，就會引起葉片組織內代謝物質的明顯變化，且變化趨勢與降低到凍害溫度點（15 ℃/0 ℃或15 ℃/2℃）的一致。