順鉑耳毒性:毛細胞死亡的分子機制及潛在靶點

萬應翠,萬珮峰,柴人杰,付小龍,孫 錦

(1.山東第一醫科大學,山東 濟南 250117;2.山東大學,山東 青島 266237;3.東南大學,江蘇 南京 211189)

順鉑又名順二氨基二氯鉑,是第一代鉑類抗腫瘤藥物,被廣泛用于治療膀胱癌、肺癌、卵巢癌等其他實體癌。順鉑通過阻滯腫瘤細胞分裂和生長,誘導細胞死亡,縮小腫瘤細胞體積,從而達到抗腫瘤的效果[1]。然而,順鉑在治療過程中也會引起腎功能不全、肝毒性、耳毒性等副作用[2]。其耳毒性主要是基于耳蝸的特殊結構(如血-迷路屏障)增加順鉑泵出的難度,導致順鉑容易積累在內耳毛細胞中[3],導致毛細胞死亡,繼而出現聽力損失。因此,本文對毛細胞的分子機制和潛在治療靶點進行綜述。

1 毛細胞的死亡方式

大量研究證實,順鉑誘導毛細胞的死亡方式主要包括:凋亡、焦亡、鐵死亡(圖1)。小鼠耳蝸外植體經順鉑處理后,毛細胞表現出大量的丟失以及TUNEL陽性信號的增加[4],這一結果證實了順鉑會誘導毛細胞的凋亡。此外,焦亡也參與了順鉑誘導的毛細胞死亡,研究發現,順鉑處理后,小鼠耳蝸毛細胞中的焦亡信號如GSDME、半胱天冬酶-3或NLRP3的表達顯著升高[5, 6],同時,研究人員通過加入GSDME或半胱天冬酶-3的抑制劑后可以挽救順鉑誘導的毛細胞死亡和聽力損失[7]。作為一種新興的細胞死亡方式——鐵死亡,近幾年一直在腫瘤方面被廣泛研究。同時,也有越來越多的研究表明鐵死亡與順鉑耳毒性息息相關。Bing[8]等發現順鉑可誘導HEI-OC1細胞中4-HNE的表達水平顯著升高和GPX4的表達降低。在小鼠模型中,同樣也發現了順鉑處理后4-HNE的表達水平增高和GPX4的表達降低,并且使用鐵死亡抑制劑Fer-1可減少毛細胞丟失和聽力損失[8, 9]。

圖1 順鉑誘導耳毒性的機制模式圖

2 ROS參與順鉑誘導的耳毒性

目前的主流觀點認為,順鉑誘導的耳毒性主要是由于活性氧(ROS)的過度積累導致的[10, 11]。ROS是正常氧代謝的副產物,是由氧化酶大量增加和抗氧化酶耗盡所產生的,這些氧化酶包括NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶和脂氧合酶[12],其中,NADPH氧化酶是ROS的主要來源[13]。在正常生理條件下,被外界刺激激活的NADPH氧化酶與胞質蛋白形成復合物,該復合物催化氧化劑反應,最終產生ROS[14]。ROS可以激活抗氧化酶,隨后,ROS通過還原反應被還原為水和氧氣,實現了胞質內的氧化還原平衡。在小鼠內耳毛細胞中,順鉑會導致抗氧化系統的失調,使得ROS的過量積累并引起DNA損傷,導致毛細胞丟失和聽力損失[15]。研究發現,天然的強效抗氧化劑Avenanthramide-C(AVN-C)可以減少順鉑誘導的HEI-OC1細胞的死亡和ROS的產生[16];在順鉑誘導的小鼠損傷模型中,AVN-C減少了外毛細胞的丟失并降低了小鼠的ABR(聽覺腦干反應)閾值。研究證實,在小鼠耳蝸外植體上,抗氧化劑呋喃硫胺的預處理可以減少ROS的過量積累并保護順鉑誘導的聽力損失[17]。此外,二甲雙胍也是一種常見的抗氧化劑,可以通過減少順鉑誘導ROS的積累來減少毛細胞死亡[18, 19]。因此,通過增強抗氧化系統減少ROS的過量積累可能成為治療順鉑耳毒性的一個重要靶點。

3 順鉑誘導毛細胞發生凋亡

凋亡是細胞程序性死亡的一種方式,主要由半胱天冬酶通過外在或內在途徑激活來調節的[20],見圖2。外在途徑是由靶細胞表面的死亡受體腫瘤壞死因子受體(TNFR)及相應的配體腫瘤壞死因子-α(TNF-α)相互作用觸發的。當細胞處于氧化應激環境中,細胞膜表面的TNFR和TNF-α相結合,激活了半胱天冬酶8(Caspase-8)和半胱天冬酶10(Caspase-10),隨后激活下游效應器半胱天冬酶3(Caspase-3)和半胱天冬酶7(Caspase-7),激活后的半胱天冬酶可降解細胞內的錯誤折疊或未折疊的蛋白,從而引起細胞凋亡[21]。內在途徑主要由半胱天冬酶9(Caspase-9)引發,該途徑受促凋亡因子(Bax、Bak等)和抗凋亡因子(Bcl-2、Bcl-xl等)之間相互平衡調節的。在氧化應激期間,細胞中的促凋亡因子和抗凋亡因子表達水平變化導致線粒體膜通透性改變,線粒體內的細胞色素C和ROS釋放于細胞質中,隨后游離的細胞色素C與凋亡酶激活因子-1結合形成凋亡小體,凋亡小體激活Caspase-9并且觸發了細胞凋亡[22]。據報道,在HEI-OC1細胞和UB-OC1細胞[23]中發現,在順鉑誘導后Caspase-3和Caspase-9被大量激活,TUNEL陽性信號的明顯增加,細胞出現凋亡。同時,使用Caspase-9的抑制劑z-LEHD-fmk和Caspase-3的抑制劑z-DEVD-fmk可預防毛細胞免受順鉑誘導的損傷[24]。最近研究表明,中藥對順鉑相關的耳毒性也具有預防和治療作用[25, 26],20 (S) -人參皂苷Rh1(Rh1)和5,7-二羥基-4-甲基香豆素(D4M)作為一種抗凋亡活性物質,它們可以減少順鉑誘導的小鼠耳蝸外植體的ROS積累和Caspase-3的表達,從而減少毛細胞的丟失,不同的是,Rh1是通過抑制MAPK通路的活性來減少順鉑誘導的毛細胞凋亡[27],而D4M是介導JNK/FoxO1途徑來預防順鉑相關的耳毒性[28]。核因子E2相關因子2(Nrf2)可以保護細胞免受氧化應激影響。Zhang等[29]研究報道,在小鼠耳蝸外植體上,使用Nrf2的激活劑TBHQ可以減少Caspase-3的表達和TUNEL陽性信號的表達,同時,在C57BL/6野生小鼠模型中,順鉑治療前用TBHQ預處理可以減少毛細胞的丟失,并且ABR閾值有所降低。綜上所述,毛細胞的凋亡在順鉑誘導的聽力損失中發揮著重要作用,抑制凋亡相關的信號通路可能成為順鉑耳毒性的潛在治療靶點。

圖2 細胞凋亡、焦亡、鐵死亡機制圖

4 順鉑誘導毛細胞發生焦亡

焦亡是由炎性小體激活的一種死亡方式,炎性小體的組裝始于細胞溶質模式識別受體,它們能夠識別病原體相關分子模式(PAMPs)和危險相關分子模式(DAMPs)[30]。細胞焦亡分為經典途徑和非經典途徑。經典途徑(圖2):當細胞處于應激環境下,PAMPs和DAMPs接受細胞內信號分子并和凋亡相關斑點樣蛋白、半胱天冬酶1前體形成炎性小體,同時Caspase-1活化。活化的Caspase-1激活GSDMD,并使其通過形成非選擇性孔來穿透細胞膜,進一步導致細胞裂解和死亡[31]。在非經典途徑中,胞質脂多糖(LPS)激活Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11,然后切割GSDMD介導NLRP3炎性小體的組裝,隨后觸發細胞焦亡[32]。焦亡是一種新發現的細胞死亡方式,自發現以來,焦亡在腫瘤方面被廣泛研究。Badr[33]等通過腹腔注射順鉑后,大鼠腎組織中的NLPR3、Caspase-1以及GSDMD顯著升高,細胞出現嚴重的焦亡并引起腎功能損傷,當使用N-乙酰半胱氨酸和綠原酸(都是具有抗炎作用)聯合用藥時,腎組織中的焦亡反應明顯降低。此外,也有研究報道,順鉑可能通過NLRP3/Caspase-1/GSDMD途徑誘導乳腺癌焦亡[34]。近期也有研究表明,焦亡在順鉑誘導的聽力損失中也發揮重要作用。Li等[35]研究證實,在HEI-OC1細胞中,類黃酮化合物柚皮苷(Nar)與順鉑聯合處理細胞時,通過實時定量PCR檢測到Nar降低了NLPR3和Caspase-1的表達,并且減少了細胞焦亡。在順鉑誘導的小鼠模型中,毛細胞中的GSDME(gasdermin家族的另一種蛋白)、NLRP3以及白細胞介素(IL)-1β、IL-18、IL-6的表達水平顯著升高,小鼠聽力受損[5]。冬凌草素(Ori)是NLRP3的抑制劑,最近有研究報道,Ori可以通過抑制NLRP3炎癥小體活化和Caspase-1/GSDMD相關的毛細胞的焦亡來挽救卡那霉素誘導的聽力損失[36],或許,Ori可能也會預防或緩解順鉑誘導的聽力損失。應進一步研究抗炎癥因子或抗焦亡相關蛋白,以減輕順鉑誘導的聽力損失。

5 順鉑誘導毛細胞發生鐵死亡

鐵死亡主要受鐵穩態和氧化應激的通路調節,其主要的兩個生化特征就是鐵積累和脂質過氧化[37](圖2)。鐵是一種必需元素,但鐵的過量積累會導致細胞出現死亡,當機體內的鐵代謝(包括其吸收、儲存、利用和消耗)出現異常時,細胞內游離的鐵離子濃度就會增加,脂質過氧化水平升高,從而誘導細胞發生鐵死亡[38]。經典的鐵死亡誘導劑erastin就是通過增加細胞內鐵的積累導致細胞死亡[39]。在鐵死亡的過程中,脂質過氧化與谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)密切相關,GPX4是一種谷胱甘肽和硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶,可以抑制鐵死亡過程中形成的脂質過氧化物。谷胱甘肽由胱氨酸調控,當胱氨酸匱乏時,谷胱甘肽的合成受到影響,繼而減少了GPX4的表達水平,從而使細胞發生鐵死亡[40]。鐵死亡的調節還涉及了其他的途徑,如甲羥戊酸通路[41]、P53(腫瘤抑制蛋白)通路[42]等。作為一種新興的細胞死亡方式,鐵死亡具有區別于其他死亡方式的明顯特征,包括線粒體體積變小、嵴減少、線粒體膜破裂,但是細胞核正常[43]。鐵死亡在腫瘤治療中發揮著重要作用,一些證據表明鐵死亡與許多病理之間存在密切的聯系,鐵死亡被廣泛認為是一種腫瘤抑制機制,鐵死亡誘導劑二氫青蒿素強烈增強順鉑對胰腺導管腺癌細胞的細胞毒性[44]。近幾年也有研究表明,鐵死亡在順鉑誘導的聽力損失過程中也發揮著關鍵作用。Mei等[45]建立了體外模擬順鉑誘導聽力損傷的模型,在HEI-OC1細胞以及小鼠耳蝸外植體中,用鐵死亡的抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)預處理后,可以降低順鉑誘導的Fe2+和脂質ROS的積累以及線粒體的損傷,減少順鉑誘導的毛細胞丟失。Fer-1也減輕了斑馬魚毛細胞中的順鉑毒性[8]。同時也有研究表明,增強GPX4等各種抗氧化酶的活性,可能減少順鉑誘導的毛細胞損傷[8, 46]。可見通過減少鐵積累和脂質過氧化可能使毛細胞免受順鉑誘導的鐵死亡,減少聽力損失。

6 小結與展望

順鉑是臨床一線抗腫瘤藥物,但嚴重的副作用限制了其使用,其中包括耳毒性。順鉑主要通過誘導毛細胞死亡從而引發聽力損失,雖然許多研究者已經開展了較多順鉑誘導毛細胞死亡的相關研究,但是其機制仍不太清楚,如何預防、減緩和治療聽力損失有待進一步探索和研究。凋亡、焦亡和鐵死亡是順鉑治療過程中主要的毛細胞死亡方式,目前已有研究證實抑制毛細胞的凋亡、焦亡和鐵死亡可能減少聽力損失,但對其防治聽力損失的確切作用尚不清楚,因此需要更多的研究來評估順鉑誘導毛細胞死亡的分子機制和潛在的治療靶點。