DIS3基因在腫瘤中的研究進展

魏 堯,解春寶,蔣靈晰,何陽軍,石 毅△

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院,人類疾病基因研究四川省重點實驗室,四川 成都 610072;2.電子科技大學醫學院,四川 成都 611731;3.西南醫科大學醫學檢驗系,四川 瀘州 646000)

腫瘤是人類健康的威脅之一,它會造成正常組織器官結構和功能的破壞,嚴重的可導致死亡。有研究發現在多種腫瘤的發生發展中存在DIS3基因的異常表達。DIS3作為核糖核酸酶是外泌體復合物的催化亞基,包含外溶核(RNB)和內溶核(PIN)結構域,可以直接作用于大量不同RNA物種的加工、周轉和監測[1],在多種腫瘤的發生發展中發揮作用,如在多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中DIS3是最常見的突變基因之一、白血病的發生也與DIS3的突變和丟失有關、DIS3基因可以促進結腸癌的發生發展、DIS3基因在黑色素瘤的發展中也起著調控作用等。本文對DIS3在一些腫瘤的最新研究進行闡述,希望為腫瘤的治療提供全新的研究方向與治療靶點。

1 DIS3基因

DIS3基因是1988年發現于裂殖酵母中。Ohkura等[2]在有絲分裂時姐妹染色單體分離相關基因的研究中鑒定出DIS3基因。DIS3基因屬于存在于從細菌到人類的大多數生物中的RNase II/RNR超家族。該基因位于人類染色體13號染色體的長臂2區1帶(13q2.1),并廣泛表達于人體各種組織中。

1.1 DIS3的結構域與蛋白結構RNA質量控制是保證轉錄完整的關鍵。輔助因子與適配體識別錯誤的RNA底物,并激活核糖核酸酶進行降解。真核生物的轉錄組主要受到核外泌體的調控,核外泌體是一種由9個亞基核心(EXOSC1-9)、分配性核糖核酸酶和DIS3蛋白(又稱為Rrp44)三部分組成的環狀結構,其中DIS3蛋白是一種高度保守的3’至5’外切核糖核酸酶,是外泌體的核心功能亞基,為外泌體提供催化活性。當RNA底物被識別后,RNA底物通常被引導通過9亞基外泌體桶狀結構內的中心區域,隨后被位于環基部的DIS3外切酶域降解。另外,一些特殊的RNA底物也能夠被DIS3蛋白直接分解而不用進入桶狀中心[3]。

人類基因組編碼DIS3家族主要有三個成員:DIS3蛋白、DIS3L蛋白和DIS3L2蛋白(見圖1)。DIS3家族蛋白通常含有一個RNB(RNA-Binding)結構域、兩個冷休克結構域(CSD)、一個S1結構域(能夠非特異性結合RNA)和一個PIN結構域。在N端,由三個半胱氨酸殘基組成的CR3基序具有重要的結構作用(參與DIS3蛋白與外泌體結合)。CSD和S1結構域都有助于與RNA結合。PIN結構域和CR3基序相互作用使DIS3錨定于外泌體核心的底部[4]。

圖1 DIS3基因基本結構與結構蛋白[3]

1.2 DIS3的蛋白功能DIS3蛋白作為可高效加工的水解酶,會優先選擇5′端磷酸化的底物以3′到5′的方向水解單鏈RNA。DIS3蛋白具有兩種不同的催化活性:內切酶活性(PIN結構域)和外切酶活性(RNB結構域)。PIN結構域采用RNase H(RNA酶H)的方式折疊,酶活性依賴于四個保守的酸性氨基酸(天冬氨酸)殘基,它們與催化活性中心的兩個鎂離子共同發揮作用。外泌體中心通道的寬度僅夠容納單鏈RNA,因此PIN結構域不能切割雙鏈RNA,但可以切割環狀RNA和線性單鏈RNA。RNB結構域的外切酶活性位點位于中心通道的底部,只有至少7個核苷酸的單鏈RNA才能到達。靶向DIS3蛋白的底物既可以直接進入催化區域,也可以通過外泌體的中心通道進入底部的核糖核酸酶外切酶或內切酶位點[5]。只要在RNA的3′端存在至少4～5個核苷酸的非結構區,DIS3蛋白就可以通過分子內或分子間二級結構分解底物[6]。

DIS3主要功能是在RNA降解系統負向調控錯誤折疊蛋白的降解[7],除了RNA降解功能之外,DIS3基因還參與了稷酒裂殖酵母的著絲點組裝,其作用是使中端染色質沉默[8]。目前已有的一些實驗表明,抑制DIS3的活性會阻礙細胞的增殖和分裂。但存在個別反常影響,例如功能降低的DIS3蛋白可以促進小鼠B細胞的增殖[9]?？傮w而言,DIS3基因在RNA代謝中具有多種功能,包括mRNA質量控制、小RNA處理、染色體分離、細胞周期進展、紡錘體組裝、甚至影響B細胞中抗體的多樣性[3]。

研究發現,人類DIS3蛋白存在兩種可變剪接的蛋白質編碼異構體,體現在編碼PIN結構域的序列不同,П亞型蛋白(ISO2)的PIN結構域比Ⅰ亞型蛋白短30個氨基酸。研究發現MM患者細胞及MM細胞株具有更高表達水平的DIS3亞型1蛋白(ISO1);慢性粒單核細胞白血病和急性髓系白血病患者樣本以及健康捐贈者樣本具有相似水平的ISO1和ISO2。兩種亞型蛋白的異常表達均可以促進血液病癌癥的進展[10]。見圖2。

1.3 DIS3家族如上所述,DIS3酶是外泌體必不可少的催化亞基,DIS3家族的DIS3蛋白、DIS3L1蛋白和DIS3L2蛋白已被證實參與重要的細胞過程,例如調控有絲分裂。DIS3L1也與外泌體相關,定位于細胞質。值得注意的是,DIS3L2可以獨立于外泌體發揮作用,并對尿苷化RNA表現出獨特的傾向。

DIS3L2基因是稷酒裂殖酵母DIS3基因的一個同源基因。DIS3L2蛋白定位于細胞質,缺乏DIS3和DIS3L1中的PIN結構域和CR3基序,這兩個都是與外泌體復合物相互作用所必需的(見圖1)。DIS3L2蛋白是具有高度保守的核酸外切酶,其突變常導致人類過度生長、Perlman綜合征和腎母細胞瘤[11]。生殖系統中的DIS3L2基因突變會導致Perlman綜合征和腎母細胞瘤。Perlman綜合征表現為先天性過度生長,是一種常染色體隱性遺傳疾病,與腎母細胞瘤易感性有關。相關研究發現DIS3L2基因的過表達抑制了人類癌細胞株的生長,而下調DIS3L2基因的表達則促進了這些細胞的生長。此外DIS3L2基因突變還存在于散發性腎母細胞瘤中[12]。除了腎母細胞瘤,DIS3L2基因還能促進肝細胞癌的進展[13]。因此,該基因被認為可以作為是腫瘤血清學檢測的指標之一。

2 DIS3基因與腫瘤

2.1 DIS3基因與MMMM是發病率僅次于惡性淋巴瘤的常見血液系統惡性疾病,?；疾∮谥欣夏耆巳?且不同地區和不同人種之間發病率有很大差異。目前平均每年的確診人數已超過14萬人。雖然MM患者的5年生存率從1975年的28%提高到2012年的56%,但目前仍然缺乏相關的特效藥[14],給我國患者造成了極大的經濟負擔。

MM的臨床表現因人而異,這種差異很大程度上是由獲得性遺傳因素驅動,這些遺傳因素使疾病永久存在并在MM發生發展過程中起重要作用。骨髓瘤細胞產生大量無功能的、完整的免疫球蛋白或不完整的免疫球蛋白,這些免疫球蛋白的積累以及異常單克隆漿細胞與骨髓微環境中其他細胞的相互作用會導致MM癥狀(CRAB癥狀)。CRAB癥狀包括血鈣增高、腎功能損傷、貧血及骨病。MM最常見的治療相關癥狀是疲勞、便秘、手足疼痛和刺痛。幾乎所有MM患者都始于意義未明的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)。每年MGUS進展為活動性(癥狀性)MM的風險約1%～2%,20年進展為MM的風險約為18%[15]。MM的診斷包括血液檢查、骨髓檢查、影像學檢查。其中血清蛋白電泳定量M蛋白、免疫固定電泳及骨髓活檢是主要診斷手段,骨髓活檢包括免疫組織化學、流式細胞術、FISH分析,根據不同檢查結果可對MM進行分型進而實施個體化治療[16]。根據影像學檢測結果,可分為四種類型:彌漫性骨骼受累(骨髓瘤)、彌漫性骨骼骨量減少、孤立性病變(漿細胞瘤)和硬化性骨髓瘤。根據電泳結果中M蛋白類型分為:IgA型、IgG型、IgD型、IgE型、IgM型、不分泌型、輕鏈型以及雙克隆型。還可根據M蛋白的輕鏈類型分為κ型和λ型。使用FISH探針可檢測染色體重復、缺失和重排。根據FISH檢測結果可將患者分為超二倍體亞型和缺失亞型。

MM目前雖無完全治愈的治療方案,但隨著技術水平不斷進步,針對的診斷和治療得到了很大的改善。其治療方法包括嵌合抗原受體T淋巴細胞療法(CAR-T)、自體造血干細胞移植(ASCT)、誘導治療、MM的支持治療、蛋白酶體抑制劑、免疫調節藥物以及單克隆抗體療法等[17,18]。針對MM的發病機制,較多的觀點是免疫球蛋白重鏈位點的易位和帶有奇數染色體的三體以及超二倍體突變。MM細胞其他染色體結構變異也被認為是MM發病的原因,包括缺失、重復、易位等。最常見的5種易位分別為t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)和t(6;14),分別出現在15%、12%、3%、2%和1%的樣本中。最常見的缺失突變包括del(13q), del(14q), del(6q), del(1p)和del(17p)[19]。除染色體變異外,基因突變與MM發病率密切相關,經常突變的基因包括TP53(36%)、KRAS(22.1%)、NRAS(15.1%)、DIS3(8.1%)和TET2/FGFR3(5.8%),以及以前未在骨髓瘤中報道的多個突變[20]。DIS3基因在MM中有較高的突變率,可能在MM的發病、進展和預后中發揮重要作用。在國內外研究中,突變基因(如TP53、DIS3、FAM46C、KDM6B和EGR1)的數量與MM預后不良有關[21]。

在DIS3蛋白功能缺陷的B細胞中,免疫球蛋白重鏈位點完整性受到影響。在NDMM(新診斷MM)中DIS3基因突變的頻率約為10%。DIS3基因突變主要發生在DIS3蛋白的活性區域,其中RNB結構域為主要突變結構域。DIS3基因突變常伴隨13號染色體長臂缺失,且在72%的病例中與13號染色體的缺失相關。研究表明,DIS3基因突變可以通過與胞嘧啶核苷脫氨酶的相互作用,間接導致體細胞染色體定位錯誤,從而導致染色體易位[22]。在大多數個體中,骨髓瘤細胞包含一個DIS3的等位基因,該等位基因存在錯義突變,并且DIS3的第二個等位基因因染色體13q區缺失而缺失[23]。所有MM特異性DIS3基因突變都是錯義突變,這些突變主要集中在RNB域,且存在3個DIS3基因熱點突變(D488, E665和R780)。國外研究分析了164例代表性患者純化骨髓漿細胞的DIS3基因PIN結構域和RNB結構域,DIS3基因在MM中的突變率為18.5%,被鑒定的變異主要是定位于RNB域的錯義突變。33例DIS3基因突變患者中有19例(57.6%)攜帶del(13q14),突變率在新診斷的MM患者中為18.5%[24]。

目前DIS3基因突變導致MM的機理尚未闡明,但國內外實驗室就其研究結果提出了一些假設:①DIS3基因的失活突變可能會破壞著絲點的形成,通過對異染色質的影響,導致姐妹染色單體分離缺陷和非整倍體形成;②DIS3基因的失活突變可能與骨髓瘤細胞中其他基因的突變協同作用以增強細胞增殖;③DIS3基因的失活突變可能會提高骨髓瘤細胞中非編碼RNA的調控水平,提高基因組突變頻率[24]。DIS3基因突變降低核糖核酸酶外切酶活性,從而提高了骨髓瘤的增殖能力。此外的其他研究也探討了可能的機制,DIS3基因過表達可顯著降低人骨髓瘤細胞增殖能力,可能與增殖細胞核抗原(PCNA)表達降低密切相關[25]。DIS3蛋白缺失破壞了外泌體10亞基的正常核定位,使其不能與核質底物結合進而導致核內RNA堆積。國外已有的研究發現RNA外泌體相關基因RBM7、SKIV2L2和DIS3發生體細胞突變,其功能缺失會上調成熟端粒酶RNA水平。雖然沒有攜帶端粒維持基因的體細胞突變,但29%有生殖系端粒維持缺陷,這也許是遺傳物質不穩定的原因[26]。

2.2 DIS3基因與其他血液腫瘤急性髓系白血病是一種異質性的血液惡性腫瘤,其病理特征是造血干細胞分化阻斷和克隆增殖。急性髓細胞白血病常見基因突變包括剪切子突變、抑癌基因突變、轉錄子突變。其中DIS3基因突變占比不大,其中錯義突變占所有患者4%,并且突變位點都在RNB結構域[27]。慢性淋巴細胞白血病(CLL)是一種老年血液病,其特征是單克隆異常淋巴細胞進行性堆積。有研究發現,在CLL患者中,DIS3基因座13q22經常丟失[28]。

2.3 DIS3基因與結腸癌結腸癌是全球常見的消化系統癌癥之一。在美國,結腸癌的發病率僅次于乳腺癌、肺癌和前列腺癌,死亡率僅次于肺癌。相關研究發現DIS3具備促進結腸癌的發生發展的作用。與腺瘤相比,結腸癌組織中DIS3基因表達顯著升高,并通過DIS3基因的沉默抑制了結腸癌細胞的增殖,同時也可以降低HCT116(結腸癌細胞株)的遷移和侵襲能力。這種基因表達顯著升高可以通過DIS3基因座13q22的擴增來解釋,該基因座改變在結腸癌細胞株HCT116中經常出現[29]。劉偉等[30]發現通過下調DIS3L2表達可增強結直腸癌干細胞的特性。國外研究發現DIS3基因在結直腸癌和肝轉移患者的表達與腺瘤相比高38倍[31]。

2.4 DIS3基因與黑色素瘤黑色素瘤皮膚癌源于皮膚黑色素細胞,是具備高轉移性質的腫瘤之一。不同的DIS3基因調控可能是淺表擴張性黑色素瘤(SSM)和結節性黑色素瘤(NM)不同臨床表現的一個原因[32]。在SSM細胞中,DIS3基因的表達下調,而在NM細胞中,DIS3基因表達上調(與正常黑素瘤細胞相比)。由于其與黑色素瘤的關系尚未明確,DIS3基因并未被鑒定為黑素瘤分子生物標志物[33]。

3 總結與展望

盡管DIS3基因已被發現與多種類型的癌癥相關,包括結直腸癌、黑色素瘤和血液腫瘤,但DIS3是抑癌基因還是促癌基因,目前還沒有共識。DIS3在不同腫瘤中呈現不同的差異表達,表明DIS3基因的作用可能在不同的組織和致癌環境中有所不同。相關腫瘤中,MM是DIS3相關性最高的腫瘤,多個位點突變均與MM發生發展相關,并在患者的長期隨訪結果中也表現出DIS3基因突變與不良結局的相關性。介于該基因與多種腫瘤均具備一定程度的相關性,因此,確定DIS3基因在腫瘤發生中的作用可能有助于開發新的治療靶點。