湖北花楸種胚離體培養與快繁技術研究

劉良夢, 趙桃娟, 黃 振, 劉 欣, 丁 婷, 陳 炙, 左燕平

(四川省林業科學研究院/森林和濕地生態恢復與保育四川省重點實驗室, 成都 610081)

湖北花楸(Sorbushupehensisc. K. Schneid.)別名雪壓花,薔薇科花楸屬落葉喬木,耐寒冷,天然分布于中國中西部地區,常以單株形式混生于闊葉林中,尚未發現湖北花楸種群。湖北花楸是阿壩州著名的彩葉樹種,秋季滿樹紅葉,葉落后白果滿枝頭,極具觀賞價值,是彩葉林帶的骨干樹種。

發展生態旅游,優化彩葉林帶樹種結構,是阿壩州鄉村振興的重要內容,而培育以湖北花楸為代表的彩葉樹種種苗是彩葉林高質量發展的基礎。目前,尚未有湖北花楸種苗批量化培育的報道,花楸屬種子的休眠[1]現象是種子繁育的主要障礙。因此,開展湖北花楸組織培養研究,建立黑水花楸組培再生技術體系,是實現黑水花楸規模化育苗的有效途徑。目前,花楸屬的組織培養僅在少數種上獲得成功,朱虹等[2]以當年生嫩梢為外植體、馬盈等[3]以腋芽為外植體、盧芹[4]以帶芽莖段和葉片為外植體,建立了歐洲喬木花楸組織培養再生體系;劉行等[5]、張成霞等[6]以種子為外植體,將無菌苗的嫩芽作為增殖材料獲得了黑果腺肋花楸生根苗,而湖北花楸組織培養尚未見報道。本研究以湖北花楸種子為外植體,研究了激素類型和濃度對種胚萌發、叢生芽誘導、幼苗生根的影響,建立湖北花楸組培再生技術體系,為湖北花楸優樹資源的開發和利用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

采樣母株位于阿壩州黑水縣沙石多鄉干斯壩村302省道邊(32°5′21.10″N,102°46′58.61″E),挑選無病害、圓潤飽滿的果實,搓洗掉果肉,在超凈工作臺上把種子放入0.1%氯化汞消毒10 min,無菌水洗4次后,剝離種皮,取出完整種胚,轉入MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L卡拉膠的初代培養基中暗培養,7 d后淘汰污染材料,無菌種胚轉入誘導培養基。

1.2 誘導培養基篩選

無菌種胚平鋪在添加不同濃度(0.25 mg/L和0.5 mg/L)6-芐基腺嘌呤(6-BA)、(0.05 mg/L和0.1 mg/L)吲哚丁酸(IBA)或(0.05 mg/L和0.1 mg/L)萘乙酸(NAA)組合的誘導培養基上培養30 d,每瓶接種1個種胚,每個處理接種10瓶,重復4次。30 d后統計平均萌發率并觀察生長表現。

1.3 增殖培養基篩選

將1.2獲得的萌芽切成1.5 cm長,帶有2～3個腋芽的莖段,把莖段轉入添加了不同濃度(0.25,0.5 mg/L和1.0 mg/L)6-BA和(0.02,0.04 mg/L和0.06 mg/L)IBA組合的誘導培養基上培養30 d,每瓶接種10個帶芽莖段,每個處理接種5瓶,重復4次。30 d后統計每個處理平均增殖率和平均芽誘導數并觀察生長表現。

1.4 生根培養基篩選

將有效芽苗(高≥1.5 cm、葉片數≥3)從莖段上切下轉入添加了不同濃度(0,0.1,0.5,1.0 mg/L)NAA和(0,0.04,0.1 mg/L)IBA組合的生根培養基上培養30 d。每個處理接種5瓶,每瓶10株,重復4次。30 d后統計各處理的平均生根率、平均生根數,綜合芽苗生長表現,篩選最佳生根培養基。

1.5 培養條件

除特殊說明外,培養條件均為培養溫度(25±2)℃,光照強度為2 500 lx,光照周期12 h/d。培養基均添加30.0 g/L蔗糖和7.0 g/L卡拉膠,pH值為5.8。

1.6 數據處理與分析

平均萌發率/%=(每瓶芽正常萌發的苗總數/每瓶種胚數)×100%;

平均芽誘導數=每瓶上誘導出的芽總數/每瓶外植體數;

平均增殖率/%=(每代有效莖段數/初始接種莖段數)×100%;

平均生根率/%=(每瓶中能生根的芽苗數量/接種芽數)×100%;

平均生根數=每株苗基部萌發的長度≥1.5 cm、清洗不脫落的不定根數/生根芽苗數。

采用DPS 16.05軟件對實驗數據進行Tukey法單因素方差分析,百分數采用反正弦平方根轉換后再進行方差分析。

2 實驗結果

2.1 誘導培養基篩選

飽滿的湖北花楸種子去種皮后種胚完整度高(圖2 B),沒有敗育現象,說明自然狀態下的種子難萌發不是由于種胚發育不完全所致,組培前處理去掉的外種皮可能是抑制種子萌發的主要障礙之一。而培養在不含激素的ck處理中的種胚平均萌發率僅5%,說明種胚存在休眠現象,需要外源激素的刺激打破休眠。

種胚接種到誘導培養基上2 d后開始萌動(圖2 C),子葉伸展,隨后子葉顏色逐漸由白變綠(圖2 D),15 d時下胚軸生長出胚根,胚根往下彎曲生長至培養基內部,胚軸延長將子葉往上抬,使得子葉脫離培養基表面(圖2 E黑三角處),同時胚芽發育出真葉(圖2 E箭頭處)。

萌發的種胚在不同誘導培養基上的生長表現差別較大,不同誘導培養基的種胚平均萌發率存在顯著差異(表1)。IBA對種胚的萌發率影響較大,6-BA則對種胚萌發后芽的生長影響較大,NAA對種胚的萌發或有抑制作用,ck的種胚萌發率僅為5%。

表2 湖北花楸莖段在不同增殖培養基中的生長表現Table 2 Growth performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. stems in different proliferation media

1～4號誘導培養基中添加的6-BA濃度為0.25 mg/L。1號培養基添加0.05 mg/L IBA,芽生長正常(圖1 A),平均萌發率達90%;隨著IBA濃度升高為0.1 mg/L,2號培養基中芽正常生長,平均萌發率降低至85%,但與1號培養基的種胚平均萌發率差異不顯著。3號培養基添加0.05 mg/L NAA,平均萌發率為12.5%,已萌發胚芽的頂芽在長出1～2片真葉后生長停滯(圖1 C),胚根逐步變黑并死亡(圖1 D),隨著NAA濃度升高為0.1 mg/L,平均萌發率降至5%;4號培養基中,下胚軸稍微膨大后即褐化死亡(圖1 E箭頭處)。

注:A為誘導培養基1中胚芽明顯伸長的外植體;B為誘導培養基2中的外植體,胚芽伸長不明顯;C為誘導培養基3中的外植體,黑三角示未伸長的胚芽;D為誘導培養基3中的異常外植體,箭頭示胚根黃化,黑三角示胚芽未伸長;E為誘導培養基4中的外植體,箭頭示下胚軸褐化死亡;F為誘導培養基5中的外植體,胚芽伸長生長,黑色框為兩個新芽特寫;G為誘導培養基6中的外植體,下胚軸生長快,胚芽伸長生長,箭頭示新生葉片易枯黃;H為誘導培養基7中的異常外植體,胚芽未發育(黑三角處),子葉和下胚軸發育;I為誘導培養基8中的死亡外植體,胚芽稍伸長,子葉褐化,箭頭示頂芽。圖1 湖北花楸種胚在不同誘導培養基中的典型表現Fig.1 Typical performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. seed embryos in different induction media

注:A為帶種皮的湖北花楸種子;B為去掉種皮的湖北花楸種胚,箭頭示下胚軸;C為湖北花楸種胚接種2 d,箭頭示子葉;D為湖北花楸接種7 d,箭頭示子葉變綠;E為湖北花楸接種15 d,箭頭示真葉。圖2 湖北花楸種胚在5號誘導培養基上的萌發過程Fig.2 Germination process of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. embryo on No.5 induction medium

5～8號誘導培養基中添加的6-BA濃度為0.5 mg/L。5號培養基添加0.05 mg/L IBA,平均萌發率可達95%,顯著高于除1號誘導培養基以外的其他誘導培養基,部分胚苗頂芽的腋芽也會萌發,腋芽強健,稍小于頂芽(圖1 F),胚苗長出4～8片深綠色真葉,胚根白色或淡黃色,根長2.0～4.0 cm;隨著IBA濃度升高為0.1 mg/L,平均萌發率降為82.5%,腋芽發生數減少,大部分只是頂芽萌發,初始2片真葉翠綠,后續新芽發育異常,易枯黃,下胚軸下半部稍膨大,與培養基接觸部位呈黑灰色(圖1 G);7號培養基添加0.5 mg/L NAA,平均萌發率為10%,大部分胚芽不發育,子葉畸形,胚根不萌發(圖1 H),隨著NAA濃度升高為0.1 mg/L,平均萌發率為2.5%,種胚不萌發或種胚萌發中褐化死亡(圖1 I)。

綜上所述,5號誘導培養基為誘導湖北花楸種胚萌發的最佳培養基。

2.2 增殖培養基篩選

由于在種胚誘導培養階段,NAA對胚芽的生長起抑制作用,而IBA促進胚芽的生長,故而在增殖階段設計6-BA與IBA組合試驗,在誘導培養基中添加0.25 mg/L 6-BA的基礎上,增加了IBA濃度的培養基組合,以篩選適宜于腋芽分化和生長的激素組合。

結果表明,湖北花楸莖段轉入不同增殖培養基后,平均增殖率和平均芽誘導數差異顯著。

1～3號增殖培養基中均添加了0.25 mg/L 6-BA,其中以添加0.04 mg/L IBA的2號增殖培養基中的莖段長勢最好,生長較快,莖長2.5～4.0 cm,芽豎直向上生長,適合作為生根材料,每個芽可切作2～3份增殖材料,平均誘導出2.08個芽,平均增殖率490.5%,老葉有黃化現象(圖3 B箭頭處),但不影響繼續培養。1號增殖培養基添加IBA濃度0.02 mg/L的芽生長相對緩慢,莖段細小,高度較2號增殖培養基矮,芽叢基部易褐化(圖3 A箭頭處),僅葉柄伸長并向上生長,平均增殖率為112.5%,幾乎沒有新的增殖材料;IBA濃度為0.06 mg/時L,莖段和芽幾乎不生長,葉彎曲生長(圖3 C箭頭處)。

注:A為增殖培養基1中的外植體,箭頭示莖段細且短;B為增殖培養基2中的外植體,植株健壯呈綠色,箭頭示植株基部葉變黃;C為增殖培養基3中的外植體,箭頭示葉彎曲;D為增殖培養基4中的外植體,箭頭示葉變黃;E為增殖培養基5中的外植體,黑三角示同一莖段出芽;F為增殖培養基6中的外植體,箭頭示葉寬大影響植株生長;G為增殖培養基7中的外植體,箭頭示葉彎曲變黃;H為增殖培養基8中的外植體,箭頭示葉卷曲枯黃死亡;I為增殖培養基9中的外植體。圖3 湖北花楸莖段在不同增殖培養基中的典型表現Fig.3 Typical performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. stems in different proliferation media

4～6號增殖培養基中均添加了0.5 mg/L 6-BA。5號增殖培養基添加0.04 mg/L IBA,莖段平均誘導4.1個芽,顯著高于其他處理,但莖段伸長并不明顯,莖長1.5～2.5 cm,大部分新芽在下一次的增殖中不能切為2份增殖材料,芽向上或向培養基內生長(圖3 E黑三角處);4號增殖培養基中的IBA濃度為0.02 mg/L,此時莖段伸長明顯,莖長2.5～3.0 cm,但葉片彎曲出現黃化(圖3 D箭頭處),平均芽誘導數1.34個;6號增殖培養基中的IBA濃度為0.06 mg/L,葉片變得寬大影響植株生長,甚至部分葉片接觸培養基后生長失控并將芽苗頂出培養基(圖3 F箭頭處),莖段幾乎不伸長生長,平均誘導出1.02個芽。

7～9號增殖培養基添加的6-BA濃度為1.0 mg/L時,莖段和芽均不生長,且葉卷曲黃化(圖3 G箭頭處),隨著IBA濃度升高,葉黃化加劇(圖3 H箭頭處),9號培養基中添加0.06 mg/L IBA,整個植株枯黃(圖3 I),植株生長受到抑制。

綜上所述,2號增殖培養基(MS+0.25 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IBA)、5號增殖培養基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IBA)為適宜的增殖培養基。

2.3 生根培養基篩選

由于增殖培養基中的芽叢誘導率高,為避免芽苗在生根中腋芽萌發增殖,因此在生根培養基中未添加6-BA,在增殖培養階段,IBA濃度0.04 mg/L的基礎上進行了調整(表3),并根據生根效果,增加了含NAA的組合。

表3 湖北花楸生根培養基篩選Table 3 Screening of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. rooting medium

1～3號生根培養基不添加NAA,1號生根培養基中未添加外源激素,結果表明,平均生根率僅為2%,芽苗幾乎不生根。2號生根培養基中含有與增殖培養基相同濃度的0.04 mg/L IBA,平均生根率為36.5%,但根系不完整,根數少,平均為1.52條根,多數芽苗僅產生1條根(圖4 A黑三角處)。IBA濃度為0.1 mg/L時,芽苗平均生根率降至1.5%;不添加IBA,芽苗平均生根率僅為2%。

注:A為生根培養基2中的芽苗,黑三角示一條根;B為生根培養基5中的芽苗,黑三角示不定根;C為生根培養基7中的芽苗,白色框為不定根和白色愈傷特寫;D為生根培養基7中的芽苗,黑三角示不定根;E為生根培養基8中的芽苗,箭頭示葉片透明;F為生根培養基10中的芽苗,箭頭示葉卷曲,黑三角示不定根。圖4 湖北花楸芽苗在不同生根培養基中的典型表現Fig.4 Typical performance of Sorbus hupehensisc. K. Schneid. bud in different rooting media

4～6號生根培養基在1～3號生根培養基的基礎上,分別添加了0.1 mg/L NAA。結果發現,4號生根培養基與1號生根培養基相比差異不顯著,芽苗基部亦無不定根分化。

5號生根培養基平均生根率為33%,與2號生根培養基相比差異不顯著,但芽苗平均根數為2.11條,顯著高于2號生根培養基中的芽苗平均根數,但出根慢,培養30 d莖段已伸長至3.0～5.0 cm,才開始產生不定根,少數芽苗產生3條不定根(圖4 B黑三角處),而6號培養基中IBA濃度為0.1 mg/L,平均生根率反而下降至5%。繼續提高生根培養基中NAA濃度至0.5 mg/L,發現平均生根率顯著提高。7號生根培養基中未添加IBA,平均生根率達84%,芽苗基部先產生白色愈傷組織,然后愈傷組織分化出數條不定根(圖4 C白色框部分),芽苗平均根數可達4.41條,隨后不定根伸長生長,同時葉展開,芽苗向上生長,植株高3.5～5.0 cm,根長4.0～6.0 cm(圖4 D黑三角處)。8號生根培養基在此基礎上添加0.04 mg/L IBA后,平均生根率降低至43.5%,芽苗平均根數降至2.53條,說明芽苗生根受到抑制,同時葉片顏色變淺(圖4 E箭頭處);隨IBA濃度升高為0.1 mg/L,平均生根率下降至1%。

當生根培養基中NAA濃度為1.0 mg/L時,10～12號生根培養基中的芽苗生長均不正常,10號生根培養基中的芽苗葉片容易卷曲,基部先產生白色愈傷組織,隨后白色愈傷組織慢慢變黃,部分黃色愈傷分化出不定根(圖4 F黑三角處),平均根數為2.52條,根長2.0～4.0 cm,但不定根生長慢,隨IBA濃度升高,平均生根率和平均生根條數降低。

綜上所述,7號生根培養基(MS+0.5 mg/L NAA)為湖北花楸最佳生根培養基。

3 討 論

花楸屬植物樹型挺拔、葉色多變、果實宿存,是四季可賞的園林景觀優良樹種[7],黑水花楸是川西高原地區原生花楸屬植物,是高原地區打造彩葉林的理想樹種。培育成片湖北花楸林是建設高質量“萬山紅遍,層林盡染”的有效途徑,因此,有必要通過組培快繁的方法,解決湖北花楸實生繁育困難的難題。

種子萌發是種胚培養獲得成功的關鍵[8]。沈海龍等[9]研究發現,低溫沙藏可以解除花楸種子休眠;梁立東等[10]研究表明,西伯利亞花楸種子萌發率僅38.25%。本研究發現,在合適的培養基中,離體胚可正常萌發成苗,而在不含激素的培養基中,種胚平均萌發率很低,需要外源激素打破休眠,誘導種胚萌發。

花楸屬植物增殖培養階段,激素類型和濃度不適應,幼苗葉片容易發生卷曲,或出現玻璃化等現象[11-12],導致有效芽數量低使得生根材料不足,既影響生根芽苗質量,也不利于繼續增殖培養。本研究發現,IBA對芽生長的影響較大,且解決了湖北花楸增殖培養時出現的葉卷曲和玻璃化現象。

生根培養是組培快繁的最后環節,是決定組培苗出圃時根系數量和活力的關鍵,生長素是植物生根的主要影響因素[13]。本研究通過添加不同濃度的NAA與IBA,發現芽苗在含有0.5 mg/L NAA的生根培養基中可誘導出不定根,而IBA對芽苗不定根的誘導效果不明顯,在后續的研究中需要進一步優化配方,減少愈傷組織的發生,直接誘導不定根從芽苗基部萌發。

本研究建立了湖北花楸種胚組培再生技術,與其他花楸屬植物組織培養研究結果不同,祁爽[14]研究表明,歐亞花楸芽苗在1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培養基中生根最好;以一年生黑果腺肋花楸嫩枝為外植體誘導出腋芽,轉入MS+1.0 mg/L 6-BA+0.08 mg/L NAA培養基中增殖,該研究認為NAA和IBA組合有利于黑果腺肋花楸生根,芽苗在1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培養基上平均生根率95%[15-16];陸爽等[17]認為,添加0.5 mg/L IBA的培養基中黑果腺肋花楸芽苗生根率最高100%;陳士剛等[18]發現,2.8 mg/L IBA適合艷麗花楸生根。說明不同花楸屬植物組培快繁技術之間的借鑒作用不大。

在構建了湖北花楸種胚快繁技術的基礎上,課題組將開展輕基質育苗試驗,并在川西高原開展無性系造林試驗,以構建完整的湖北花楸組培快繁和栽培技術體系。