不同抗旱性狗牙根種質的抗旱生理響應差異分析

張一龍， 孫曉梵， 李碩， 李培英， 孫宗玖

（新疆農業大學草業學院，新疆草地資源與生態自治區重點實驗室，西部干旱區草地資源與生態教育部重點實驗室，烏魯木齊 830052）

水是人類賴以生存的重要資源，隨著氣候變化、人口增加及城鎮化影響，水資源短缺以及水資源分布不均勻問題日益加劇[1]。已有研究表明，新疆的土壤干旱方式以緩慢干旱為主，其干旱覆蓋范圍在2005年以后增幅越發明顯[2]。在水資源短缺時，草坪綠化水首先被壓縮，因而揭示草種抗旱機制及采用育種技術提高草種抗旱性成為亟待解決的問題。

研究表明，干旱脅迫下植物氧自由基產生與清除的平衡被破壞，活性氧大量積累，引發膜脂過氧化和膜磷脂的脫酯化反應啟動，使葉綠素超微結構受到損害，甚至解體；光合色素含量下降，光合作用受到抑制，植物生長下降；有毒物質的積累進一步加劇植物代謝紊亂，最終使植物受損，甚至死亡[3]。植物對干旱的響應通常受脅迫程度和持續時間及植物基因型和發育階段的影響[4]。植物在長期適應不同環境過程中，也形成了不同干旱適應機制。研究表明，不同草種間抗旱性存在差異，且同種草種不同基因型間也呈現出不同的抗旱性[5]。孫明偉等[6]研究發現，強抗旱性與弱抗旱性的羊草（Leymus chinensis）葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量在干旱脅迫后均升高，且強抗旱性羊草的葉片光合色素含量敏感指數顯著高于弱抗旱性羊草。張娜[7]研究表明，隨著干旱脅迫程度的加劇，水分敏感品種‘壩筱3號’葉片的葉綠素含量和光合速率呈遞減趨勢，而抗旱品種‘蒙燕1號’呈先升后降趨勢；2種燕麥（Avena sativa）的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性及可溶性蛋白含量均隨著干旱脅迫程度的加劇先降低后升高，其中抗旱品種的增幅更快、更多。

狗牙根（Cynodon dactylon）為禾本科多年生匍匐莖-根莖兼有的草本植物，在全世界廣泛分布，因其具有繁殖能力強、適應性廣、抗旱性強、坪用性好等優良特性，成為暖季型草坪草種質研究的熱點。國內外圍繞狗牙根抗旱性開展了大量研究，但主要集中在育成品種的抗旱差異及抗旱機制[8-9]，對一些特殊生態型或新選育材料的研究較少，且對不同抗旱性狗牙根的干旱生理響應差異分析研究略顯不足。另外，不同狗牙根在干旱下各指標的響應也存在差異，段敏敏等[10]研究表明，輕度水分脅迫下，敏旱型狗牙根種質的脯氨酸含量顯著高于抗旱型；中度水分脅迫下，抗旱型狗牙根種質脯氨酸含量顯著高于敏旱型；重度水分脅迫下，2種抗旱性狗牙根種質間差異不明顯。Ajtahed等[11]研究表明，敏旱型狗牙根種質較耐旱型狗牙根種質具有更高的過氧化氫酶（catalase，CAT)和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。因此，需進一步探明不同抗旱性狗牙根種質的干旱生理響應機制。

新疆擁有豐富的野生狗牙根種質資源，由于長期生長于干旱環境，形成了豐富的遺傳變異。本研究在前期研究[12]基礎上，以抗旱性存在顯著差異的4種狗牙根種質為研究對象，采用漸進式緩慢干旱法對其進行干旱處理，通過對土壤含水量及狗牙根抗旱相關指標進行測定，探討不同抗旱性野生狗牙根種質對抗旱的響應差異，明確其抗旱響應機制，篩選出不同干旱脅迫程度下的關鍵性指標，為狗牙根抗旱機理研究及抗旱狗牙根新品種選育提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以課題組前期研究篩選出的4份新疆狗牙根[12]為試驗材料，根據其抗旱性劃分為2類，具體信息見表1。

表1 供試材料來源及抗旱性Table 1 Origins and drought resistances of test materials

1.2 試驗設計

1.2.1 育苗及擴繁 將各供試狗牙根種質的單株進行擴繁，且以蓋度為95%以上的盆栽草為原始繁殖材料，將直徑為20 cm、深15 cm的盆栽草平均分成大小、體積基本一致的4等份，統一保留地下部分5 cm，將均分后的草移栽至裝有1.2 kg混合土壤（花土∶基質土∶黃沙=2∶2∶1，體積比）的塑料盆（直徑8 cm，深15 cm）中，盆中混合土壤的有機質含量15.95 %，堿解氮含量129.58 mg·kg-1，速效磷含量13.59 mg·kg-1，速效鉀含量99.75 mg·kg-1。每個材料移栽12盆，正常澆水、施肥、修剪等養護管理60 d，待其蓋度達90%以上時進行干旱試驗。

1.2.2 干旱處理 于2020年8—9月在新疆農業大學室外試驗地采用漸進式緩慢干旱法對供試材料進行干旱脅迫處理，即首先充分灌溉至水從塑料盆底部排水孔流出，待無水再流出時，對所有供試材料進行實時稱重，并記錄，以此時含水量為土壤飽和含水量，此時記作干旱0 d，此后每3 d于下午6點對供試材料進行稱重，計算實時蒸散量；稱重后進行補水，每次補充灌溉蒸散量的50%（各材料補水量一致，以失水最多材料為準）。為確保試驗不受外界水分干擾，降雨前用塑料布遮蓋試驗材料。分別于干旱處理第0、第7、第14和第20天采集植株頂端向下第2片葉片，用于測定生理指標，每個指標3次生物學重復。

1.3 測定指標及方法

使用鋁盒環刀取土樣，迅速稱取鮮重（fresh weight，FW），然后烘干稱重，計算土壤含水量（soil water content，SWC）；采用飽和稱重法[13]測定葉片相對含水量（relative water content，RWC）；采用電導率法[13]測定相對電導率（electrical conductivity，EC）；采用二甲基亞砜法[14]測定光合色素含量（photosynthetic pigment content，PPC）；采用氮藍四唑光化還原法[15]測定超氧化物歧化酶活性（SOD）；采用愈創木酚法[15]測定過氧化物酶（POD）活性；采用過氧化氫還原法[15]測定過氧化氫酶（CAT）活性;采用硫代巴比妥酸法[15]測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用考馬斯亮藍法[15]測定可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量；采用茚三酮顯色法[16]測定脯氨酸（proline content，Pro）含量。

1.4 數據處理

采用Excel 2016軟件進行數據預處理，用SPSS 26.0軟件中One-way ANOVA進行不同干旱時間及不同基因型間的生理指標的差異顯著性分析，采用Origin 2018制圖。根據各項指標數據的平均值計算單項指標的抗旱系數，并以此為依據，利用隸屬函數法對供試材料的抗旱性進行綜合評價；采用灰色關聯度分析篩選不同干旱程度下的抗旱鑒定關鍵指標[17-18]。

以抗旱系數（α）來評價不同材料間的抗旱性，某項指標的抗旱系數的計算公式如下。

為減少不同指標間的差異，參照劉一明等[17]將抗旱系數進行標準化，計算公式如下。

式中，X為某一指標的測定值，Xmin為該測定指標的最小值，Xmax為該測定指標的最大值。

若某一指標與抗旱性呈正相關，則采用公式（2）計算其隸屬函數值；若呈負相關，則采用公式（3）進行計算。最后依照公式（4）將各指標的隸屬函數值進行累加求其平均值。參照伏兵哲等[18]的方法，以隸屬函數值作為參考數列、各指標作為比較數列進行灰色關聯度分析。關聯系數和關聯度的計算公式如下。

式中，Ψi（k）為關聯系數，ri為灰色關聯度。|x0(k)-xi(k)|表示參考數列與比較數列間的絕對差值，minimink|x0(k)-xi(k)|為二級最小差值，maxi maxk|x0(k)-xi(k)|為二級最大差值。ρ為分辨系數，本試驗中取值為0.5[18]。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對土壤含水量的影響

由圖1可知，隨干旱脅迫時間的延長，土壤含水量顯著性降低；在干旱第0、第7、第14、第20天時，土壤含水量平均為39.85%、29.75%、22.88%、11.20%。干旱初始（第0天），土壤含水量為39.74%～40.31%，不同材料間差異不顯著；干旱第7天時，C10、C32的土壤含水量較C118、C138顯著降低9.28%～10.65%（P＜0.05）；干旱第14天時，C10的土壤含水量顯著低于C118、C138；干旱第20天時，C118、C138的土壤含水量顯著高于C10、C32。

圖1 干旱脅迫下不同狗牙根的土壤含水量和葉片相對含水量Fig.1 Soil water content and relative leaf water content of different bermudagrass under drought stress

2.2 干旱脅迫對狗牙根葉片生理指標的影響

2.2.1 相對含水量 由圖1可知，隨干旱脅迫時間的延長，供試材料葉片的相對含水量均顯著降低。干旱0 d時，C10、C32、C138的葉片相對含水量顯著高于C118（P＜0.05）；干旱7 d時，C32葉片相對含水量顯著高于C118和C138（P＜0.05）；干旱14 d時，各材料葉片相對含水量為39.43%～53.16%，其中C10顯著低于C118、C138；干旱20 d時，各材料葉片相對含水量下降至25.61%～38.77%，其中C118、C138較C10、C32顯著提高29.32%～51.38%。

2.2.2 葉片相對電導率和丙二醛含量 由圖2可知，隨干旱脅迫時間的延長，葉片的相對電導率顯著增加。干旱0 d時，不同材料間的相對電導率差異不顯著；干旱7 d時，C10、C32的相對電導率顯著高于C118、C138。干旱14 d時，C32、C10相對電導率分別為40.87%、38.77%，顯著高于C118（27.74%）、C138（26.34%）。干旱20 d時，各材料的相對電導率為52.09%～71.80%，不同材料間差異顯著，表現為C32＞C10＞C118＞C138。

圖2 干旱脅迫下不同狗牙根葉片相對電導率和丙二醛含量Fig.2 Relative electrical conductivity and malondialdehyde content of different bermudagrass leaves under drought stress

隨干旱脅迫時間的延長，狗牙根葉片中丙二醛含量呈上升趨勢，于干旱0、7、14、20 d時分別為5.16、5.93、9.78、17.36 μmol·g-1。干旱0 d時，不同材料間丙二醛含量差異不顯著；干旱7 d時，C32的丙二醛含量顯著高于C10、C118、C138；干旱14 d，各材料的丙二醛含量為7.97～11.85 μmol·g-1，其中C10、C32顯著高于C118、C138；干旱20 d時，葉片中丙二醛含量達到峰值，為14.85～21.17 μmol·g-1，其中C10顯著高于C118、C138。

2.2.3 光合色素含量 干旱脅迫下，不同狗牙根種質葉片的光合色素含量呈現不同的變化趨勢（圖3）。隨著干旱脅迫程度的加劇，C118的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量呈下降趨勢；而C138、C32、C10表現為先增后降的趨勢，其中在干旱7 d時達到峰值，說明適度干旱可能有助于一些狗牙根種質葉片光合色素含量的增加。C118在干旱脅迫0～20 d均表現出較高的光合色素含量，其中干旱0 d時，其葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量含量分別為1.80、0.45、0.97、2.73 mg·g-1，較其他種質顯著提高25.00%～96.40%。C138的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量高于C32、C10；且其類胡蘿卜素含量在干旱14 d后表現為最高，干旱20 d時，其類胡蘿卜素含量為0.50 mg·g-1，較其他種質顯著提高35.14%～56.25%。

圖3 干旱脅迫下不同狗牙根光合色素含量Fig.3 Photosynthetic pigment content of different bermudagrass under drought stress

2.2.4 抗氧化酶活性 4份材料的SOD、CAT、POD活性在干旱脅迫下均表現出相同的變化趨勢，即隨著干旱脅迫程度的加劇，抗氧化酶活性呈先增后降的趨勢，但不同酶達到峰值時間有所不同，SOD活性在干旱脅迫7 d達到峰值，而CAT、POD活性在干旱脅迫14 d達到峰值（圖4）。

圖4 干旱脅迫下不同狗牙根葉片抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activities of different bermudagrass leaves under drought stress

干旱0 d時，C118的POD活性較其他材料顯著提高8.71%～32.49%；干旱14 d時，各材料的POD活性均達最高，為10.05～14.77 U·g-1·min-1，其中C138、C118顯著高于C10；干旱20 d時，C138的POD活性顯著高于C118、C10。CAT活性的變化趨勢與POD類似，于干旱14 d時達到峰值，為13.24～16.68 U·g-1·min-1，其中C138的CAT活性顯著高于其他材料。干旱0 d時，不同材料間SOD活性無顯著差異；干旱7 d時，各種質SOD活性均達峰值，為373.34～461.81 U·g-1·min-1，較干旱0 d時增加35.39%～76.21%，其中C32顯著低于其他材料；干旱20 d時，C118和C138的SOD活性差異不顯著，但較C10、C32顯著提高20.00%～50.73%。

2.2.5 滲透調節物質含量 隨著干旱脅迫的加劇，敏旱材料C10、C32的可溶性蛋白含量呈先增后降趨勢，于干旱14 d時達到峰值；而抗旱材料C118、C138則呈一直增加趨勢，于干旱20 d時達到峰值（圖5）。4份材料的脯氨酸含量均表現出隨干旱脅迫的加劇顯著上升。其中，干旱0 d時脯氨酸為77.37～107.44 μg·g-1，不同材料間差異不顯著；干旱7～20 d，C138、C118的脯氨酸含量均顯著高于C10、C32；脯氨酸含量于干旱20 d時達到峰值，為784.73～1 465.88 μg·g-1（圖5）。

圖5 干旱脅迫下不同狗牙根葉片可溶性蛋白和脯氨酸含量Fig.5 Soluble protein and proline content of different bermudagrass leaves under drought stress

2.3 熱圖聚類分析

由熱圖聚類分析（圖6）可知，輕度干旱（7 d）時，SOD活性較高，4份材料受損害程度均較輕，葉片的EC和MDA含量均較低。隨著干旱脅迫程度的加劇，抗旱、敏旱材料被明顯區分開來。層次聚類分析表明，干旱14 d時，抗旱材料表現出更高的CAT、POD活性，表明其清除活性氧的能力更強，因而細胞膜受損程度較小；干旱20 d時，抗旱材料通過大量積累Pro與SP來抵御干旱脅迫，而敏旱材料則表現為SOD、CAT、POD活性顯著下降，Pro、SP積累緩慢，導致MDA含量與EC激增，表明植株受損較為嚴重。

圖6 4份狗牙根干旱處理7～20 d時各指標的熱圖聚類分析Fig.6 Heat map cluster analysis of each index of 4 bermudagrass under drought treatment for 7～20 d

2.4 不同干旱脅迫下關鍵抗旱指標的篩選

對4份狗牙根在不同干旱脅迫時間的抗旱隸屬函數值進行計算（表2），并基于此進行指標抗旱關聯度分析（表3），結果與熱圖聚類分析相一致。干旱7 d時，材料間的抗旱隸屬值為0.482 2～0.575 7，不同材料間差異較小；干旱14與20 d時，各材料抗旱隸屬值間的差異逐漸增大，其中C138、C118高于C32、C10。

表3 不同干旱時間下各指標與狗牙根抗旱的關聯度Table 3 Correlations between various indicators and bermudagrass drought resistance under different drought times

為探究在不同干旱脅迫下各指標對狗牙根抗旱性的影響，以旱脅迫處理下各指標的平均隸屬函數值為參考數列X0，將葉片相對含水量、相對電導率、總葉綠素含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量的抗旱系數值分別作為比較數列X1、X2、X3、……X12進行灰色關聯分析，得出各指標與狗牙根抗旱性的關聯度。關聯度數值越大，表明該指標對狗牙根抗旱性的影響更顯著。由表3可知，干旱7 d時葉片的丙二醛含量、相對電導率、相對含水量對抗旱性影響較大；干旱14 d時，葉片的相對電導率、類胡蘿卜素含量、SOD活性于抗旱性的關聯度較大；干旱20 d時，葉片的脯氨酸和可溶性蛋白含量及相對含水量對抗旱性影響較大。

3 討論

3.1 干旱脅迫對狗牙根光合色素的影響

植物體內水分虧缺會直接影響葉綠體結構，進而影響葉綠素含量[19]。在干旱脅迫下，抗性越強的種質葉綠體結構完整度越高，葉綠素含量也越高[20]，與本研究結果一致。在整個干旱期內，抗旱種質的總葉綠素含量均高于敏旱種質，其中C118的總葉綠素含量在干旱脅迫的各個時期均為最高，尤其在干旱0 d時，C118的總葉綠素含量較其他材料高58.72%～96.40%，表明其本身具備較高的總葉綠素含量，有利于在干旱脅迫下維持光合作用，從而表現出較優的抗旱性能。胡楊等[21]研究表明，干旱脅迫降低了細穗檉柳（Tamarix leptostachys）幼苗葉片中葉綠素a的含量，對葉綠素b含量無顯著影響。本研究表明，干旱脅迫對狗牙根葉片中葉綠素a、b都會造成顯著影響。這可能是由于草本和灌木本身差異及對干旱脅迫的響應機制不同所造成的。另外，類胡蘿卜素是植物體內重要的抗氧化物質，在減輕和消除由干旱等逆境引發的活性氧傷害方面發揮著重要作用[22]。本研究發現，不同種質的類胡蘿卜素含量對干旱脅迫的響應不同，C118雖然在干旱0 d時有較高的類胡蘿卜素含量，但其隨著干旱脅迫表現為下降趨勢；而其余3份材料則表現為輕度脅迫（7d）時類胡蘿卜素含量增加，其中抗旱種質C138的增幅最大（33.93%），干旱脅迫7～20 d時類胡蘿卜素含量降低，但C138依然能夠維持相對較高的含量（0.50 mg·g-1），這可能是其抗旱性強的原因之一。總之，即使都是抗旱種質，但其抗旱機制仍存在差異，C118表現為在干旱各個時期均有較高的葉綠素含量，而C138則表現為維持較高的類胡蘿卜素含量。

3.2 干旱脅迫對狗牙根酶保護系統的影響

SOD、POD、CAT是生物體內清除活性氧的主要保護酶[23]。張然等[24]研究表明，干旱脅迫下11份草地早熟禾（Poa pratensis）的SOD、POD和CAT活性顯著升高，但不同材料的增幅存在差異。本研究發現，4份供試狗牙根種質葉片的SOD、POD、CAT活性均隨干旱脅迫程度的加劇呈先增后降趨勢，說明各種質在干旱下都存在通過提高保護酶活性來抵御逆境、減輕傷害的適應機制，但其活性和對干旱的敏感性因逆境條件和基因型的不同而存在差異，且植物抗氧化的防御會有極限，當脅迫程度超過其極限，便會呈現下降趨勢，這與張翠梅等[25]研究結果一致。抗氧化酶之間的相互協同作用能夠高效清除植物體內產生的活性氧，減輕植物細胞受到的氧化損傷，從而達到緩解干旱脅迫的作用。SOD被稱為植物防御活性氧的“第一道防線”，本研究結果表明，SOD酶活性在干旱7 d時達到峰值，隨后呈逐漸下降趨勢，表明干旱脅迫時SOD率先發揮作用；CAT和POD活性在干旱脅迫7 d時上升趨勢并不明顯，在干旱脅迫14 d時顯著上升，表明此時CAT、POD參與機體抗旱響應，與SOD共同清除活性氧。趙春程等[26]對多年生黑麥草（Lolium perenne）的抗旱響應研究也得到了類似的結論。另外本研究發現，在干旱脅迫下，抗旱種質的抗氧化酶活性增速更快、增幅更大，因此清除活性氧的能力更強，且其SOD在干旱后期（干旱20 d）也表現出較高的活性，這可能也是其抗旱性強的原因之一。

3.3 干旱脅迫對狗牙根滲透調節物質的影響

滲透調節物質的積累是植物響應干旱脅迫最直接的方式之一，脯氨酸和可溶性蛋白是植物在干旱脅迫下產生的有效滲透物質。脯氨酸與可溶性蛋白的積累可以降低植物細胞內的水勢，防止水分外流，延緩干旱脅迫對細胞造成的損傷，同時起到保護細胞內大分子結構的作用[27]。研究表明，植物在正常生長環境下，游離脯氨酸常常會轉化為其他物質；而在干旱環境下，游離脯氨酸的轉化效率極低，使其快速積累、參與蛋白質組成[28]，因而干旱脅迫下，草坪草葉片中可溶性蛋白含量的顯著增加及脯氨酸的大量積累與緩解干旱脅迫有著密不可分的關系[29]，這與本研究結論一致。本研究發現，狗牙根敏旱種質葉片的可溶性蛋白含量在干旱14 d時達到峰值，而抗旱種質的可溶性蛋白含量則一直呈現上升趨勢；干旱脅迫下各供試種質的脯氨酸含量都有所增加，但抗旱種質增幅更大，積累更快，從而表現出更好的抗旱性能。

3.4 不同干旱脅迫下影響狗牙根抗旱性的關鍵指標

植物抵御或忍耐干旱脅迫是非常復雜的生理過程，其對干旱的響應受基因型、干旱程度、干旱持續時間的影響。李江艷等[30]利用灰色關聯分析發現不同水分脅迫下，影響鴨茅（Dactylis glomerata）苗期抗旱性的有效指標存在差異，輕度干旱下葉片相對含水量及葉綠素和MDA含量與抗旱性密切相關；而重度干旱下RWC及可溶性蛋白和可溶性糖含量對抗旱性影響較大。田小霞等[31]通過逐步回歸分析發現葉片相對含水量、脯氨酸含量等指標對供試材料的抗旱性有顯著影響。本研究利用灰色關聯分析發現，在早期干旱脅迫（干旱7 d）時葉片的丙二醛含量、相對電導率、相對含水量對狗牙根的抗旱性影響較大；在干旱脅迫中期（干旱14 d），葉片相對電導率、類胡蘿卜素含量、SOD活性與抗旱性關聯度較大；在干旱脅迫后期（干旱20 d）時，葉片的相對含水量及脯氨酸和可溶性蛋白含量對狗牙根抗旱性影響較大。