好氧反硝化菌Acinetobacter sp. A3生長及脫氮特性影響因素的研究

余艷鴿 甘申東 商放澤 王獻昆 方嘉聲

(1. 中電建生態環境集團有限公司,廣東 深圳 518102;2. 東莞理工學院生態環境與建筑工程學院,廣東 東莞 523808)

氮超標是引起水體黑臭、富營養化的主要原因,生物脫氮具有效率高、成本低、環境友好的優點,是最理想的脫氮方法。傳統脫氮技術主要依賴硝化和反硝化微生物,他們所需反應條件不同,導致兩個過程需要在不同反應器中進行,增加了反應器構造的復雜程度和運行難度。近年來,隨著生物學的發展,生物脫氮技術由單純的工藝改革向以生物學特性促進工藝改革的方向發展[1]。20世紀80年代,好氧反硝化菌引起了人們的關注[1-2]。好氧反硝化能夠實現硝化和反硝化反應在同一反應器中進行,不需要提供厭氧、好氧兩種反應條件,簡化了生物脫氮工藝環節,有效降低裝置運行成本,在生物脫氮工程應用中優勢獨特。這一新興生物脫氮菌種和工藝的出現,有助于解決目前傳統生物脫氮工藝中遇到的瓶頸問題[3]。

研究表明,好氧反硝化菌普遍存在于富磷河流、水庫沉積物、水稻土壤、濕地等自然界中[1,2,4,5]。已報道篩選出的好氧反硝化菌主要有副球菌屬(Paracoccus sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、產堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)等[6]。這些菌種對高、中、低濃度氨氮廢水均有較好的脫氮效果[3,7-9]。由于實際復雜環境對菌種培育成為優勢菌種存在較大難度,目前好氧反硝化菌實際應用多集中在實驗室小試規模。將微生物菌種固定化可有效減少環境因素的影響,提高微生物優勢菌種數量和脫氮效率[10-13]。此外,好氧反硝化菌發酵條件的優化,可為固定化菌劑制備提供大量菌種。

本研究從處理黑臭水體的生物接觸氧化反應器中,篩選出一株鑒定為不動桿菌(Acinetobacter sp. A3)的高效好氧反硝化菌種,實驗結果顯示該菌株可在好氧條件下顯著去除黑臭水體中的總氮濃度。選取氮源、碳氮比、pH值、溫度等環境因子研究分析其對該不動桿菌株生長活性及脫氮作用的影響,優化該菌株的發酵條件,為進一步推進好氧反硝化菌的實際應用奠定理論基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

培養基配方:稱量3.42 g CH3OONa,0.61 g NaNO3,0.44 g K2HPO4·3H2O,0.20 gMgSO4·7H2O,0.02 g CaCl2和0.005 g FeSO4·7H2O,以及量取0.1 mL 微量元素母液,于燒杯中,隨后加入蒸餾水混勻,再移至1 L容量瓶中定容,備用。

1.2 好氧反硝化菌株來源

該好氧反硝化菌株從處理黑臭水體的生物接觸氧化反應器生物膜上分離得來,經基因測序(16S rDNA)分析,鑒定為不動桿菌Acinetobacter sp. A3(簡稱菌株A3)。現保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC 16620。

1.3 菌株培養方法

采用上述培養基進行擴大化培養菌株A3,用接種環從斜面接種菌株A3至滅菌的含150 mL的已滅菌的反硝化培養基中, 30℃恒溫,設置150 rpm/min搖床振動頻率,培養至對數生長期,得到菌株A3懸液。

1.4 氮源成分對菌株A3生長及脫氮特性影響

1.5 碳氮比對菌株A3生長及脫氮特性影響

1.6 初始pH值對菌株A3生長及脫氮特性影響

1.7 溫度對菌株A3生長及脫氮特性影響

1.8 分析方法

細菌生長量采用光電比濁法。當光線通過菌懸液時,由于菌體的散射及吸收作用,光線透過率降低。在一定范圍內,微生物細胞濃度與光密度(簡稱OD值)成正比,而光密度或透光度可用光電池精確測出。光波的選擇通常在400～700 nm之間,本文選用600 nm光波測定菌株A3菌懸液的OD值,以此來反映菌株A3的生長活性。

氮源、C/N、初始pH、溫度等影響因素考察實驗中,均采用可見光分光光度計(上海菁華,722S) 測量菌株A3菌懸液在600 nm的吸光度(簡稱OD600),吸光度范圍是-0.301～3A。

2 實驗結果與討論

2.1 氮源環境因子的影響結果分析

2.2 碳氮比環境因子的影響結果分析

碳氮比(C/N)是影響好氧反硝化菌生長及脫氮性能最關鍵的環境因素之一,是反硝化過程中電子供體與受體比的度量指標。為了有效進行脫氮,需要適當劑量的碳源。如果碳含量較低,電子流就不能滿足細胞生長所需的能量,從而影響細胞生長和反硝化作用。然而,如果碳含量高于最佳濃度,那么反硝化速率的增加是非常有限的[2,15]。據報道,大多數異養細菌的最佳碳氮比在8～10之間[16-18]。如圖2a,本文的研究結果表明,不同C/N對菌株A3對數生長期、生長速度以及細胞最高產量均有影響。當C/N為2時,菌株A3的對數生長期僅持續了約6 h(4～10 h),在10 h后生長停滯。在對數生長期的生長速率僅為0.066 OD600/h,最大生物量為0.542 OD600。當C/N增至4時,菌株A3對數生長期的持續時間明顯延長至10 h(0～10 h),生長速率為0.092 OD600/h,最大生物量提高至1.494 OD600。當C/N繼續增加到10和15時,菌株A3的對數生長期延長至12 h(4～16 h),但生長速率有所減緩,分別為0.063 OD600/h和0.060 OD600/h;同時,最大生物量也分別下降為1.37 OD600和1.23 OD600。

圖2 不同C/N條件下菌株A3的生長活性和濃度變化(b, c)及降解速率(d)

2.3 初始pH值環境因子的影響結果分析

圖3 不同pH值條件下菌株A3的生長和NO3-N濃度變化(b, c)及降解速率(d)

2.4 溫度環境因子的影響結果分析

溫度是影響微生物活性的重要因子之一,低溫或高溫會嚴重抑制微生物活性,導致微生物生長緩慢[2]。大多數研究表明,好氧反硝化的有效溫度在25～37℃之間的中溫范圍內[22-25]。從圖4a可知,當溫度為40℃時,菌株A3沒有生長,說明該菌株不是嗜溫菌[21],高溫會抑制菌株的生長。當溫度為20℃升高至25℃時,菌株A3快速生長。當培養溫度為30～35℃之間時,菌株A3生長最快,且對總氮的降解能力最高(圖4b)。這是由于溫度升高,加快了硝化酶的轉化活性,促進了對氮的降解[25]。因此,發酵時的培養溫度宜為30～35℃。

圖4 不同溫度條件下菌株A3的生長(a)及濃度的變化情況(b)

3 結論

好氧反硝化技術在黑臭水體生物脫氮中具有獨特優勢,其核心在于特定菌株的篩選和發酵培養。本文從處理黑臭水體的生物接觸氧化反應器中,篩選出具有高效好氧反硝化能力的不動桿菌株A3,探究了氮源、碳氮比、初始pH、溫度等環境因子對該菌株生長活性和脫氮性能的影響。主要結論如下:

(3)菌株A3在初始pH為7～9,溫度為30～35℃時生長最快。

(5)菌株A3有較強的環境適應能力,可采用該菌株制備微生物菌劑,用于污水處理設備的快速啟動、水體凈化等領域,有助于推進好氧反硝化菌的實際應用,具有廣泛的應用前景。