不同凍存方法對大鼠脂肪來源干細胞生物學特性的影響

王靜 劉洪利 潘福勤 唐亮

[摘要]目的：研究不同凍存方法對脂肪來源干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）生物學特性的影響。方法：體外分離培養SD大鼠腹股溝及附睪周圍的脂肪組織，取第三代ADSCs凍存于液氮。實驗分為三組：對照組A組為非凍存細胞，B組使用無血清非程序凍存液凍存細胞，C組使用傳統凍存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）凍存細胞。12個月后復蘇ADSCs，通過對比ADSCs的表面抗原、細胞凋亡、增殖及成骨分化情況，分析各組ADSCs生物學性能的差異。結果：各組細胞高表達CD29、CD90；A、B兩組細胞的凋亡率顯著低于C組（P＜0.05）；B、C兩組的增殖情況和A組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），B組細胞的成骨分化能力要優于C組（P＜0.05）。結論：無血清非程序凍存液凍存ADSCs的效果要優于傳統凍存液。

[關鍵詞]脂肪來源干細胞；低溫保存；凍存液；凋亡率；成骨分化

[中圖分類號]R331? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）06-0108-04

Effects of Different Cryopreservation Methods on Biological Characteristics of Adipose Stem Cells in Rats

WANG Jing，LIU Hongli，PAN Fuqin，TANG Liang

（Cangzhou Medical College，Cangzhou 061000，Hebei，China）

Abstract： Objective? To study the effects of different cryopreservation methods on the biological characteristics of ADSCs. Methods? Tissue from groin and epididymis of SD rats was isolated and cultured invitro， the third passage cells were frozen in liquid nitrogen. The experiment was divided into three groups： control group A was non-cryopreservation cells， In group B， cells were cryopreserved with serum-free non-programmed cryopreservation method， The cells in group C were cryopreserved with conventional cryopreservation method （DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1）. ADSCs were resuscitated after 12 months， Through contrast the surface antigen of ADSCs， cell apoptosis， cell proliferation assay and osteogenic differentiation results. To analyse the difference of ADSCs in each group. Results? CD29 and CD90 were highly expressed in each group.The apoptosis rate of cells in group A and B was significantly lower than that in group C（P＜0.05）.There was no significant difference in proliferation between group B and group C（P＞0.05）. The osteogenic differentiation ability of group B was better than that of group C（P＜0.05）. Conclusion? The effect of serum-free non-programmed cryopreservation method on ADSCs was better than that of conventional cryopreservation method.

Key words： adipose-derived stem cells; cryopreservation; cryoprotectants; apoptosis rate; osteogenic differentiation

ADSCs取材容易，具有自我增殖和多向分化潛能[1-2]，可通過分泌各種因子促進創面愈合[3]，在醫療美容中有重要作用。多項研究證實ADSCs與支架材料結合后，其成骨能力明顯提高[4-7]，有望成為骨組織工程理想的種子細胞，在再生醫學的治療方面具有良好的臨床應用前景[8]。隨著美容醫學及組織工程學的發展，人們對ADSCs的需求量隨之越來越大。目前，低溫冷凍是細胞長期保存的常用方法，一方面可降低細胞污染的風險，另一方面能減少細胞因傳代而引起的遺傳變異，避免細胞衰老。然而，在細胞凍存和復蘇過程產生的低溫損傷會對細胞的結構、代謝途徑及活性產生極大影響，因此需要找到一種適宜的凍存方法，使低溫冷凍細胞的活性可以接近正常水平，從而降低細胞凍存凋亡率。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑：雄性SD大鼠，購于河北省實驗中心；L-DMEM、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清FBS（Gibco，美國）、細胞凍存液（普諾賽，中國）、Annexin V APC凋亡檢測試劑盒（BioGems，美國）、CCK-8（博士德，中國）；單克隆抗體CD29、CD90（Abcam，美國）；ALP染色試劑盒（碧云天，中國）；茜素紅染色試劑盒（Solarbio公司，中國）；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）；OCN、RUN-2單克隆抗體（Thermo，美國）；DMSO、地塞米松、β-磷酸甘油鈉、抗壞血酸、維生素D3（Sigma，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠ADSCs的提取：無菌條件下從SD大鼠腹股溝及附睪周圍分離脂肪組織，PBS沖洗2次，去掉肉眼可見的結締組織，眼科剪剪成漿糊狀，用2倍體積的I型膠酶37℃消化60 min，終止消化后200目篩網過濾，1 000 r/min離心10 min，DMEM重懸細胞。

1.2.2 細胞的凍存與分組：①A組取正常培養的第4～6代ADSCs；②B組取第3～5代ADSCs，胰酶消化后，收集細胞，調整細胞密度為5×108/L，加入無血清非程序凍存液，裝入凍存管。-80℃冰箱過夜，24 h之后轉入液氮；③C組取第3～5代ADSCs，胰酶消化后，收集細胞，調整細胞密度為5×108/L，加入凍存液（DMEM∶FBS∶DMSO=5∶4∶1），裝入凍存管，4℃冰箱30 min，-20℃冰箱2 h，-80℃冰箱過夜，之后轉入液氮。

1.2.3 大鼠ADSCs的復蘇：凍存12個月后，從液氮中將ADSCs取出，立即放入37℃水浴箱，振蕩使其快速融化，向凍存管中加入少量培養基，將細胞混合液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10% FBS的DMEM，放置于培養箱中培養。

1.2.4 大鼠ADSCs的鑒定：取復蘇的ADSCs，胰蛋白酶消化后調整細胞濃度為5×l08/L，每管加入200 ?l細胞懸液，5 ?l CD29抗體、2 ?l CD90抗體，冰上避光孵育30 min，PBS沖洗2次后重懸細胞，1 h內采用流式細胞儀檢測。

1.2.5 大鼠ADSCs的凋亡：染色緩沖液清洗細胞2次，1×106/ml的細胞濃度重懸細胞，100 ?l細胞懸液中加入5 ?l的Annexin V共軛物，5 ?l 7-AAD溶液，混勻細胞，25℃避光孵育15 min，加入400 ?l Annexin V結合緩沖液，采用凋亡檢測試劑盒進行檢測。

1.2.6 大鼠ADSCs成骨誘導：將細胞接種到６孔板，待細胞融合達80%，用成骨誘導培養基（10% FBS的DMEM+0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-磷酸甘油鈉+0.05 g/L抗壞血酸）進行誘導，每隔2 d換液１次。

1.2.7 大鼠ADSCs的增殖情況：CCK-8法測定成骨誘導后各組ADSCs的增殖水平，分別在成骨誘導第1、3、5、7、9 d時，胰酶消化細胞，調整細胞濃度為2×1010/L，取100 ?l細胞懸液移入96孔板，每孔加10 ?l CCK-8培養基，孵育1.5 h，酶標儀測量450 nm下的OD值。

1.2.8 ALP染色和茜素紅染色：成骨誘導7 d后，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛室溫固定細胞2 min，PBS清洗后用TBST潤洗并浸泡，棄去TBST，每孔加入ALP染色試劑500μl，室溫下避光孵育10～15 min，通過共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況。成骨誘導14 d后，4℃，4%多聚甲醛，固定細胞25 min，PBS清洗，40 mmol/L茜素紅（pH 4.1）室溫染色20 min，觀察拍照。

1.2.9 免疫熒光染色：免疫熒光染色觀察OCN、RUNX2的蛋白表達情況，成骨誘導14 d后，4%多聚甲醛，室溫孵育細胞25 min，PBS清洗3次，每次5 min，0.5% Triton X-100室溫通透膜細胞15 min，PBS清洗3次，5%BSA室溫封閉1 h，PBS清洗，分別加入一抗OCN（1∶100）和RUNX2（1∶100），孵育細胞并4℃過夜，第2天，PBS清洗3次，避光孵育二抗（1∶50）1 h，DAPI染色15 min，共聚焦顯微鏡觀察。

2? 結果

2.1 流式細胞術檢測ADSCs的表面抗原：凍存組ADSCs復蘇后，用流式細胞術檢測ADSCs的表面特異性標記物，結果顯示B、C組CD29和CD90的共同陽性表達率分別為97.85%、97.45%，與未凍存組A組（98.74%）相比，差異無統計學意義（P＞0.05），表明凍存復蘇對ADSCs表面抗原無明顯影響，細胞并未因凍存而發生變異。見圖1。

2.2 凋亡檢測試劑盒檢測ADSCs的凋亡情況：凍存組ADSCs復蘇后，用凋亡檢測試劑盒檢測ADSCs的凋亡情況，其中各組細胞的凋亡率分別為2.41%、2.54%和5.53%，C組ADSCs的凋亡率明顯高于其他兩組，差異有統計學意義（P＜0.05），而無血清非程序凍存液B組和未凍存組A組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 CCK-8測定ADSCs的增殖活性：CCK-8法測定細胞的增殖能力，前2 d細胞的生長處于滯留期，之后細胞進入對數生長期，生長迅速。當細胞融合達到80%～90%時，因接觸抑制導致細胞進入生長抑制階段，生長曲線呈“S”形。凍存組（B組、C組）細胞在第7天后進入生長平臺期，而未凍存組A組細胞在第9天時活性依然較高，其中凍存組B、C組細胞的增殖能力與未凍存組A組比較差異無統計學意義，但B組更接近未凍存組。見圖3。

2.4 ALP染色和茜素紅染色評估ADSCs的成骨分化能力：細胞成骨能力隨ALP含量的增加而呈遞增趨勢，經成骨誘導7 d后ALP染色結果見圖4，A、B組細胞內ALP染色基本持平，C組細胞ALP染色明顯降低。成骨誘導14 d后茜素紅染色結果見圖5，與A、B兩組相比，C組細胞內茜素紅染色顯著降低，這可能和細胞的凋亡率增加導致細胞數量減少有關。見圖4～5。

2.5 免疫熒光檢測OCN、RUNX2的表達：用免疫熒光染色檢測特定成骨蛋白OCN，RUNX2在ADSCs的蛋白表達。A組與B組OCN熒光強度相近，且細胞數量較多。而C組OCN的熒光強度稍低，細胞數量較少。RUNX2免疫熒光染色圖像和OCN顯示同樣的結果。見圖6。

3? 討論

間充質干細胞，在骨及軟骨再生、創面愈合、改善瘢痕等方面有巨大的優勢和潛能[9]，ADSCs屬于多能間充質干細胞，除了能分泌多種生物活性因子，促進內皮細胞的增殖、遷移進而加速血管生成外，還可以通過細胞間的直接接觸促進相鄰組織細胞的增殖和遷移[10]。ADSCs能貼附支架材料生長，并在特定條件下（添加成骨誘導液）定向成骨分化，于體內、體外均具良好的成骨效應[11-13]，是骨組織工程的理想選擇。然而體外長期培養，反復傳代，會使細胞的生物學特性發生改變，影響細胞功能。低溫凍存是長期保存細胞的有效方法，可彌補以上不足。

低溫凍存和復蘇的過程，可對細胞膜產生致死性的破壞，因此需加入冷凍保護劑。目前最常用的細胞凍存液是DMSO結合一定濃度的FBS溶液。DMSO是一種滲透性保護劑，但有一定的毒性，長期保存會增加細胞死亡率。血清中含有豐富的營養物質，能穩定細胞膜、調整細胞內滲透壓，減少凍存和儲存中活性氧自由基對細胞的傷害[14]。但價格昂貴，且血清所含促細胞因子及活性物質的比例不同，凍存效果不一。因此，本研究應用了一種無血清非程序細胞凍存液。

該凍存液中添加了細胞沉降穩定劑，可延緩細胞在凍存過程中的沉降速率，防止細胞互相擠壓，影響凍存效果。另外，添加了細胞膜保護劑、滲透性細胞膜內保護劑、非滲透性細胞保護劑等多種冷凍保護劑，這些成分在溶液中同水分子結合，發生水合作用，弱化水的結晶過程使溶液的黏性增加從而減少冰晶的形成，能大大降低細胞在凍存過程中冰晶對于細胞的損傷，有效提高細胞復蘇存活率。

該凍存液凍存步驟簡單，無需將細胞多次轉移后再投入液氮中，減少了每次轉移過程中由于溫度急劇變化而造成的細胞損傷。譚菊等[15]研究發現鼠胚成纖維細胞系（STO）細胞于-70℃冰箱中平衡過夜，再轉移至液氮中超低溫冷凍是較為理想的保存方法。實驗結果也進一步證實低溫冷凍后細胞的均能成功地復蘇，流式細胞術檢測結果顯示細胞高表達ADSCs相關的表面抗原CD29、CD90，說明細胞仍保留ADSCs表面抗原的特性，具有低免疫原性。凋亡實驗表明無血清非程序凍存液B組和對照組A組凋亡率接近，顯著低于C組。其原因主要在于B組在保存過程中降溫相對穩定，且包含多種冷凍保護劑。

本實驗從經濟、合理性考慮，建立了一種較為適合ADSCs的凍存方法，為ADSCs的長期存儲和應用提供了實驗依據。為ADSCs在骨組織工程、口腔頜面部疾病領域中的應用提供了理論支持。

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[收稿時間]2022-5-13

本文引用格式：王靜，劉洪利，潘福勤，等.不同凍存方法對大鼠脂肪來源干細胞生物學特性的影響[J].中國美容醫學，2023，32（6）：104-111.