槲皮素-納米銀抗菌紗布的研制及體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究

許林林 曹斐然 吳曉琴 邱華 王銀龍

[摘要]目的：在紗布表面通過(guò)原位還原法制備槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌涂層，并探究其抗菌效率及生物相容性。方法：利用槲皮素易溶于堿難溶于酸的特性，通過(guò)堿酸重析出的方法在紗布表面形成均勻的非晶包裹層，將其浸入硝酸銀溶液中，制備出槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌紗布。掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）觀察樣品表面形貌、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析表面元素組成、能量散布分析儀（Energy Dispersive Spectrometer，EDS）分析樣品表面元素分布情況，瓊脂平面擴(kuò)散法試驗(yàn)、吸收法實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗菌性能；通過(guò)CCK-8法評(píng)價(jià)（Cell Counting Kit-8）細(xì)胞毒性；利用結(jié)晶紫染色法在顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)目形態(tài)。結(jié)果：SEM顯示槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌紗布組（Cotton gauze- quercetin/Ag group，CG-Q/Ag組）紗布表面形成光滑槲皮素包裹層，在槲皮素包裹層表面通過(guò)原位還原反應(yīng)成功搭載了納米銀顆粒，EDS檢測(cè)顯示CG-Q/Ag組納米銀成功搭載在紗布纖維表面并且均勻分布；抗菌結(jié)果顯示瓊脂平面擴(kuò)散法試驗(yàn)中CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag0.1組周圍有透亮的抑菌環(huán)，吸收法實(shí)驗(yàn)中CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag0.1抑菌率＞95%優(yōu)于其余各組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CCK-8實(shí)驗(yàn)中顯示CG-Q/Ag0.5具有良好的生物相容性；結(jié)論：槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌紗布在實(shí)現(xiàn)有效抑菌能力時(shí)還具備良好的生物相容性，堿酸重析出法構(gòu)建槲皮素非晶包裹層并且原位還原生成銀納米顆粒的策略為紗布載銀改性提供了一種新的技術(shù)路線。

[關(guān)鍵詞]槲皮素；納米銀；原位還原；綠色制備；抗菌活性；復(fù)合抗菌紗布

[中圖分類號(hào)]R644? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2023）06-0112-06

Preparation of Quercetin Nano Silver Antibacterial Gauze and its Antibacterial Experiment in Vitro

XU Linlin，CAO Feiran，WU Xiaoqin，QIU Hua，WANG Yinlong

（Department of Stomatology/Affiliated Stomatological Hospital of Anhui Medical University，Anhui Provincial Key Laboratory of Oral Disease Research，Hefei 230032，Anhui，China）

Abstract： Objective? Quercetin nano silver composite antibacterial coating was prepared on the surface of gauze by in-situ reduction method. At the same time， its antibacterial efficiency and biocompatibility were explored. Methods? Taking advantage of the characteristics that quercetin is easy to dissolve in alkali but difficult to dissolve in acid， a uniform amorphous coating is formed on the surface of the gauze by alkali acid precipitation method. Then it was immersed in silver nitrate solution to prepare quercetin nano silver composite antibacterial gauze.The surface morphology of the samples was observed by scanning electron microscope （SEM）;the surface element composition was analyzed by X-ray photoelectron spectroscopy （XPS）;the antibacterial properties were evaluated by agar plane diffusion test and absorption test. Cytotoxicity was evaluated by CCK-8 method; Crystal violet staining was used to observe the number and morphology of cells under the microscope. Results? SEM showed that smooth quercetin coating layer was formed on the surface of CG-Q/Ag group gauze， and nano silver particles were successfully loaded on the surface of quercetin coating layer through in-situ reduction reaction. EDS showed that the CG-Q/Ag group nano-silver was successfully and uniformly loaded on the surface of the gauze fiber. In agar plane diffusion test， the antibacterial results showed that there were clear antibacterial rings around CG-Q/Ag0.5 and CG-Q/Ag0.1; the antibacterial rates of CG-Q/Ag0.5 and CG-Q/Ag0.1 in absorption test were better than those of other groups， and the difference was statistically significant （P＜0.05）;CCK-8 experiment showed that CG-Q/Ag0.5 had good biocompatibility. Conclusion? Quercetin-nanosilver composite antibacterial gauze has good biocompatibility while achieving effective bacteriostatic ability. Strategy， that use the alkaline acid reprecipitation method to construct the quercetin amorphous coating and in situ reduction to generate silver nanoparticles， provides a new green technical route for the modification of gauze carrying silver.

Key words： quercetin; nano silver; in-situ reduction; green preparation; antimicrobial activity; composite antibacterial gauze

目前，納米銀抗菌紗布因其良好的廣譜抗菌效果在燒傷[1]、創(chuàng)傷的創(chuàng)面治療中表現(xiàn)出良好的治療效果，應(yīng)用前景十分廣闊。納米銀傳統(tǒng)的制備方法包括物理方法和化學(xué)方法，但是這些所需設(shè)備技術(shù)要求高，生產(chǎn)成本高昂，而且在制備過(guò)程中使用到的有機(jī)溶劑可能會(huì)殘留在納米銀顆粒之中影響產(chǎn)品的質(zhì)量，存在潛在的環(huán)境和生物風(fēng)險(xiǎn)[2]，在一定程度上限制了納米銀在抗菌紗布制備中的應(yīng)用[3]。因此，使用一種高效，簡(jiǎn)易，無(wú)害的方法在紗布表面原位還原制備納米銀抗菌紗布具有重要意義。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中植物的花、果、葉實(shí)中，具有抗菌[4]、抗炎[5]、鎮(zhèn)痛[6]、抗病毒[7]、抗癌、心血管保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)等作用[8]。槲皮素易溶于堿難溶于酸，可利用此特性在紗布表面形成均勻一致的槲皮素非晶包裹層。

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)堿液溶解槲皮素，然后浸潤(rùn)紗布，再將紗布迅速置入酸液中，通過(guò)重析出方法在紗布纖維表面構(gòu)建均勻的非晶包裹層；再利用槲皮素還原硝酸銀在紗布表面原位形成槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌層，賦予紗布抗菌能力與良好的生物相容性，以期為構(gòu)建載銀紗布提供一條新的綠色技術(shù)路線。

1? 材料和方法

1.1 主要材料及設(shè)備：GeminiSEM 300掃描電鏡（ZEISS 公司，德國(guó)）；酶標(biāo)儀（BiO-TEK公司，美國(guó)）；X射線多晶衍射儀（Rigaku，日本）；倒置顯微鏡（萊卡公司，德國(guó)）；精密電子天平（Sartorius，德國(guó)）；超純水系統(tǒng)（RiOs8，美國(guó)）；微量移液槍（Eppendorf公司，德國(guó)）；高壓蒸汽滅菌鍋（HVE-50，日本）；高速離心機(jī)（北京六一，中國(guó)）；主要材料：醫(yī)用紗布?jí)K（振德醫(yī)療，中國(guó)）；槲皮素；L-929小鼠成纖維細(xì)胞（上海細(xì)胞庫(kù)，中國(guó)）；胎牛血清（Gibco，新西蘭）；24 孔板（Hy Clone，美國(guó)）；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 脫脂紗布預(yù)處理：將普通醫(yī)用脫脂紗布裁剪為4 cm×4 cm的正方形若干塊，放入培養(yǎng)皿中備用設(shè)為普通紗布組（Cotton gauze group，CG組）。

1.3 制作抗菌紗布：向4 mg/L槲皮素懸濁液中滴入1 mol/L NaOH溶液使槲皮素恰好完全溶解，將堿性槲皮素溶液倒入培養(yǎng)皿中浸沒(méi)紗布，再向培養(yǎng)皿中滴入1 mol/L HCl，待紗布表面形成一層槲皮素包裹層后，使用蒸餾水反復(fù)沖洗紗布表面多余試劑，烘干備用設(shè)為槲皮素-紗布組（Cotton gauze-quercetin group，CG-Q組）。將含槲皮素紗布分別浸泡在1 mg/L AgNO3、0.5 mg/L AgNO3、0.1 mg/L AgNO3、0.05 mg/L AgNO3、0.01 mg/L AgNO3中并放置在UV光下靜置30 min后，使用蒸餾水反復(fù)沖洗紗布表面多余試劑，烘干即可獲得槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌紗布組（Cotton gauze-quercetin/Ag group，CG-Q/Ag組）樣品。見(jiàn)圖1。

1.4 樣品表征：使用掃描電子顯微鏡觀察附著在紗布上CG-Q/Ag的形貌特征及納米銀分布情況。

1.5 紗布的抗菌性能研究：參照紡織品抗菌性能評(píng)價(jià)中的瓊脂平皿擴(kuò)散法[9]，定性評(píng)價(jià)材料的抗菌性能。配制瓊脂固體培養(yǎng)基，并在上表面均勻涂布金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S aureus）。將空白原始紗布和CG-Q/Ag抗菌紗布剪成1 cm×1 cm的正方形，將樣品分為空白紗布對(duì)照組以及各濃度梯度試驗(yàn)組。將各組樣品置于涂布菌液的培養(yǎng)基上，輕輕按壓使樣品與菌液充分接觸，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌帶寬度。抑菌帶寬度的計(jì)算公式為：A=（D-d）/2。式中A為抑菌帶寬度/mm；D為抑菌帶的外徑平均值/mm；d為試樣邊長(zhǎng)/mm。參照紡織品抗菌性能評(píng)價(jià)吸收法[10]，定量評(píng)價(jià)材料的抗菌性能。將經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)的菌液稀釋至濃度為1×106～3×106 CFU/ml，取試驗(yàn)菌液150μl分布滴入實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組樣品中，使樣品完全浸透，培養(yǎng)條件為：（37±2）℃，時(shí)間24 h。在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中分別加入1 ml的肉湯，超聲洗脫5 min，梯度稀釋后取150 μl涂布于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：（37±2）℃，時(shí)間24 h，計(jì)數(shù)。抑菌率的計(jì)算公式為：抑菌率（%）=（B-C）/B×100%。式中B為空白紗布對(duì)照組接種后培養(yǎng)24 h后的細(xì)菌數(shù)（CFU）；C為試驗(yàn)組細(xì)菌接種后培養(yǎng)24 h后的菌落數(shù)（CFU）。見(jiàn)表1。

1.6 紗布的生物相容性測(cè)試：用CCK-8法和結(jié)晶紫染色法檢測(cè)槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌紗布對(duì)L-929的細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)紗布的生物相容性。

1.6.1 CCK-8比色法：①將L-929細(xì)胞懸浮液以8×103個(gè)/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔200μl，先在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境下培養(yǎng)24 h；②用完全培養(yǎng)液浸泡1 cm×1 cm空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各濃度梯度紗布制取浸提液；③然后分別取200μl浸提液加入L-929細(xì)胞孔中，每種提取液重復(fù)4孔/板，其中空白紗布為對(duì)照組；④上述細(xì)胞放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24、72、96 h，將10μl CCK-8溶液加入上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞中，充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，并計(jì)算均值，同時(shí)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

1.6.2 結(jié)晶紫染色：將L-929細(xì)胞以4×104個(gè)/孔加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，先在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。用含2%小牛血清的RPMIl640培養(yǎng)液浸泡1 cm×1 cm CG-Q紗布和空白紗布制取浸提液，然后分別取500 μl實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組浸提液加入L-929細(xì)胞孔中，每種提取液重復(fù)4孔/板。將上述24孔板放置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境下培養(yǎng)72 h。棄上清液，用PBS洗滌一次，每孔加入10%甲醇溶液0.5 ml固定30 s，吸盡甲醇溶液，每孔加結(jié)晶紫染液0.5 ml，靜置20 min。用蒸餾水震蕩洗滌各孔，將24孔培養(yǎng)板倒置于吸水紙直至干燥。在倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目并拍照記錄。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以（x?±s）的形式表達(dá)。使用SPSS 16.0軟件，三組及其以上比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 表面形貌表征：表面形貌結(jié)果電鏡掃描結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示普通脫脂紗布表面可見(jiàn)凹凸不平的纖維間隙；CG-Q組紗布表面形成槲皮素非結(jié)晶包裹涂層，該涂層均勻一致，表面光滑；CG-Q/Ag組在槲皮素包裹層表面搭載了納米銀顆粒，納米銀顆粒呈立方形，球形或柱狀，平均粒徑較小，約25 nm，納米銀顆粒均勻地分布在紗布纖維表面以及孔隙中。EDS能譜結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示CG-Q/Ag組紗布表面檢測(cè)出C、O、Ag元素，Ag元素在紗布均勻分布于紗布表面與間隙中。這與電鏡掃描結(jié)果一致。

2.2 表面元素分析：利用X射線光電子能譜技術(shù)（XPS）對(duì)各組紗布表面進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在各組樣品中均觀察到C1s峰及O1s峰；其中CG-Q組的C原子與氧原子比為68.42∶31.58高于CG組65.60∶34.40；纖維素化學(xué)式（C6H10O5）n，槲皮素化學(xué)式為C15H10O7，槲皮素碳氧比高于纖維素，CG-Q組較CG組碳氧比上升說(shuō)明槲皮素成功搭載紗布表面。在CG-Ag組中，觀察到Ag3 d衍射峰，納米銀成功搭載于紗布表面。見(jiàn)表4。

2.3 抗菌性能結(jié)果：瓊脂平面擴(kuò)散法結(jié)果顯示，CG-Q/Ag0.01、CG-Q/Ag0.05、CG-Q/Ag0.1組均未見(jiàn)抑菌環(huán)，CG-Q/Ag0.1組雖未見(jiàn)抑菌環(huán)但其紗布底部見(jiàn)細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照組樣品相比略有減少；CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag1組樣品周圍見(jiàn)透亮抑菌環(huán)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)處理的復(fù)合抗菌紗布具有很好的抗菌效果。見(jiàn)圖5、表2。吸收法抗菌結(jié)果顯示CG組較空白組菌落較多并且其抑菌率小于0，可能是因?yàn)槠胀ㄡt(yī)用紗布表面無(wú)抗菌性并且為細(xì)菌提供了更多的附著位點(diǎn)，使細(xì)菌更容易生長(zhǎng)繁殖。其余各組包括CG-Q組，均表現(xiàn)出一定的抑菌效果。其中CG-Q/Ag1與CG-Q/Ag0.5組抑菌效果最好，抑菌率＞95%。見(jiàn)圖6。

2.4 生物相容性結(jié)果：在1 d時(shí)CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag1較其余組細(xì)胞數(shù)量較少，但隨著時(shí)間推移至3 d時(shí)CG-Q/Ag0.5組與其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），5 d時(shí)CG-Q/Ag0.5、CG-Q/Ag1細(xì)胞數(shù)量均已達(dá)到正常水平，與其余組均無(wú)差異（P＞0.05）。CCK-8試驗(yàn)顯示CG-Q/Ag0.5組短期內(nèi)雖然會(huì)影響L-929成纖維細(xì)胞增殖，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量顯著增多。在培養(yǎng)72 h后，在倒置顯微鏡下觀察到CG-Q/Ag0.5組L-929成纖維細(xì)胞單層緊密排列著，呈梭形、星形或不規(guī)則的多變形的正常形態(tài)，與其余組相比細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯減少，形態(tài)未見(jiàn)明顯差別。見(jiàn)圖7～8。

3? 討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，涂層在紗布表面結(jié)合穩(wěn)定牢固，在電鏡下可以觀察到在紗布表面生成了納米銀顆粒，且納米銀顆粒多為抗菌效果更好的立方形[11]，XPS和EDS能譜分析顯示紗布表面Ag元素分布均勻，抗菌評(píng)價(jià)顯示該紗布具有很好的抗菌性能，其中納米銀起主要抗菌作用，Ag+可使細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜破裂和干擾細(xì)胞酶活性從而殺死細(xì)菌；另外槲皮素也通過(guò)改變細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性和阻礙核酸和蛋白質(zhì)的合成的起到一定的抗菌作用。CCK-8和結(jié)晶紫染色試驗(yàn)顯示槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌紗布具有良好的生物相容性。

納米銀因其獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)[12]不僅抗菌效果好范圍廣泛、持續(xù)殺菌時(shí)效長(zhǎng)，穩(wěn)定性好并且不易產(chǎn)生耐藥性[13]。利用物理和化學(xué)的方法合成納米銀常常需要在苛刻的條件下進(jìn)行，并且合成過(guò)程中常常需要使用到有毒的化學(xué)藥劑，例如Gopiraman利用硼氫化鈉在硝酸銀水溶液中合成納米銀，并將其負(fù)載到纖維素納米纖維上成功制備了載納米銀生物紗布，但是硼氫化鈉經(jīng)皮膚吸收后對(duì)人體具有一定有毒性作用[14]。Beltran等高通量和精密火焰噴霧合成方法成功合成納米銀顆粒，但是這類物理合成方法耗能較高，而且試驗(yàn)設(shè)備及操作程序非常復(fù)雜[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿酸重析出的方法在紗布表面形成槲皮素結(jié)晶層，將其浸入硝酸銀溶液中，在紗布表面綠色地原位制備槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌涂層。綠色法制備納米銀相較于傳統(tǒng)化學(xué)和物理方法具有制備工藝簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和及生物安全性更好等優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)菌感染是影響傷口愈合的最常見(jiàn)的因素之一[16]，感染傷口的細(xì)菌一旦定值在傷口表面形成生物膜[17]，會(huì)使感染傷口轉(zhuǎn)化為慢性傷口[19]，慢性傷口如果得不到及時(shí)正確的處理，細(xì)菌入血導(dǎo)致菌血癥及敗血癥，甚至?xí)l(fā)展成感染性休克，感染傷口經(jīng)久不愈，增加了患者的痛苦和病死率[19]。金黃色葡萄球菌在慢性傷口形成中的作用卓著[20]，故本實(shí)驗(yàn)以金黃色球菌作為主要抗菌對(duì)象。在全身應(yīng)用抗生素的療法中，局部傷口處的藥物濃度往往難以達(dá)到防治感染的有效水平，如果盲目增加藥物劑量，會(huì)加重藥物的不良反應(yīng)，而且易產(chǎn)生耐藥性[21]。因此，選擇在傷口處使用高效，安全的紗布是一種有效的治療手段[22]。納米銀抗菌紗布因納米銀獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，可通過(guò)破壞細(xì)胞壁，干擾脫氧核糖核酸（DNA）復(fù)制，降低生物酶的活性，從而達(dá)到抑菌的效果[23-25]。納米銀對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌及部分病毒等均有抗菌作用，具有廣譜抗菌效果[26]，甚至對(duì)耐藥菌株都顯示出很較強(qiáng)的抗菌效果。局部使用抗菌紗布不但能保護(hù)傷口起到暫時(shí)性屏障作用，又可以避免或控制傷口感染[27]。在治療慢性傷口或者潛在的抗生素耐藥菌時(shí)，槲皮素-納米銀復(fù)合抗菌紗的廣譜抗菌性和獨(dú)特的殺菌機(jī)制會(huì)發(fā)揮重要作用，但是該紗布缺少長(zhǎng)期動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，仍需探索研究。

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[收稿日期]2022-06-07

本文引用格式：許林林，曹斐然，吳曉琴，等.槲皮素-納米銀抗菌紗布的研制及體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2023，32（6）：112-117.