皮膚衰老評價方法的研究進展

宋姣 陳斌 秦燕 張文娟 魯楠

[摘要]本文介紹了皮膚老化的形式及外在皮膚表象，回顧了目前常用抗衰老功效評估方法及各自的優缺點，包括生物化學方法、細胞生物學法、動物試驗法和人體試驗法，同時著重介紹了皮膚超聲、在體熒光光譜法此類新型的評估方法在抗衰老臨床評估中的應用，以及不同配方劑型對產品功效性能的影響。

[關鍵詞]抗衰老；功效評估；體外評估；在體評估；在體熒光光譜法；配方影響

[中圖分類號]R751? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）06-0203-03

Research Progress of Skin Aging Evaluation Methods

SONG Jiao，CHEN Bin，QIN Yan，ZHANG Wenjuan，LU Nan

（Shanghai Pechoin Biotechnology Co.Ltd， Shanghai 201499，China）

Abstract： This paper briefly introduces the form of skin aging and external skin appearance， reviews the common anti-aging efficacy evaluation methods and their advantages and disadvantages， including biochemical method， cell biology method， animal test and human clinical evaluation method， and focuses on the application of new evaluation methods such as skin ultrasound and in vivo fluorescence spectroscopy in the clinical anti-aging evaluation ， and the influence of formulation type on efficacy evaluation.

Key words： anti-aging; efficacy evaluation; external evaluation; in vivo evaluation; in vivo fluorescence spectrometry; formula influence

隨著人們對抗衰老護膚品需求的增加，護膚品相應功效評估的方法也在增加，尤其是2021年中國國家藥品監督管理局發布了《化妝品功效評價宣稱規范》，指出了化妝品在注冊備案前需要提供相應的功效宣稱的依據，更是推動了抗衰老護膚品功效評估方法的開發及完善。本文回顧了目前常用抗衰老化妝品功效評估的方法及其各自的優缺點，重點介紹皮膚超聲和熒光光譜法在人體臨床功效評估中的應用和配方劑型對功效評估的影響。

1? 皮膚老化：光老化與自然老化

皮膚老化一般有兩種表現形式，自然老化和光老化。自然老化主要指隨著年齡的增長，由機體內存在的如遺傳、內分泌及免疫功能等不可抗拒因素引起的老化。自然老化的外在表現為皮膚變得薄且扁平、干燥、彈性降低，分子生物學水平上的表現為細胞外基質普遍萎縮，成纖維細胞數量減少，膠原蛋白和彈性蛋白水平降低[1]。光老化主要由于紫外線的作用，加重了自然衰老的進程，氣候變化以及環境污染等對皮膚光老化也有一定的影響[2]。光老化的皮膚會出現皺紋、松弛、粗糙、色素沉著、膚色不均勻等，表皮厚度增加，結締組織改變。光老化皮膚的關鍵特征是表皮-真皮結合處下方無定形彈性蛋白物質的積累[1]。

抗衰老是通過使用此類功效性的護膚品來預防或減緩皮膚因自然或/和光老化而產生的皺紋、干燥、松弛和色斑等。

2? 如何評估護膚品的抗衰老功效

目前，抗衰老的功效評估包括體外評估、動物實驗法和在體評估法。

2.1 抗衰老體外評估法：體外評估主要有生物化學法、細胞生物學法。生物化學法主要是自由基清除試驗，這些過量的自由基主要是由氧化應激反應產生，可以造成和或加速皮膚自然老化和光老化。常用的自由基主要有1.1-二苯基-2-苦肼基（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基、超氧自由基、單線氧自由基、氮自由基等。

細胞生物學法主要有2D細胞法和3D皮膚模型法，此法主要是通過2D細胞（角質形成細胞、成纖維細胞等）[3-4]及3D皮膚模型中和衰老相關指標的變化來評估樣品的功效性，常見的檢測指標有水通道蛋白（Aquaporin，AQP）、與氧化相關的酶及蛋白、與屏障功能相關的緊密連接蛋白[5]、與彈性相關的膠原蛋白等。

體外評估具有簡單、快速，高通量篩選的優勢，主要用來評估原料的功效性或者探索原料/產品發揮功效的機理通路。但此類方法也存在一定的缺陷，測試因素單一，不能全面反映測試樣品的特性，無法考慮樣品真實的代謝吸收等影響因素。

2.2 抗衰老動物實驗法：動物實驗法主要通過化學物質或紫外線等對老鼠進行誘導來進行皮膚老化造模，然后通過皮膚觀察、組織染色、免疫染色或者試劑盒檢測等來分析和老化相關的指標[6]。D-半乳糖亞急性衰老模型是目前國內最常用的動物衰老模型之一，正常劑量的D-半乳糖可在肝臟被酶解代謝為葡萄糖，而過量的超出機體負荷的D-半乳糖則會致使機體產生活性氧自由基從而降低了抗氧化能力，使體內超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase， GSH-Px）水平下降，提高丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）含量，最終對機體造成氧化損傷[7]。

動物實驗可以考慮測試樣品真實的吸收代謝等性能，但其也存在物種差異，與人應用的效能也存在一定的差異，且隨著歐盟禁止使用動物進行化妝品研究后，日本的資生堂等公司也陸續提出取消動物實驗，后續動物實驗能否繼續用于化妝品的功效測試也有待商榷。

2.3 抗衰老在體評估：抗衰老在體評估主要有臨床評估、圖像分析、儀器評估，要獲得相對準確客觀的評估結果，往往需要這些方法聯合應用，建立一套綜合評估的方案。

2.3.1 臨床評估法：臨床評估主要包括受試者自評和專家評估兩個部分。受試者自評主要通過問卷來獲得受試者自身對于使用產品前后皮膚老化表象的變化。專家評估主要是由有經驗的皮膚科醫生根據事先制定的標準對測試部位的皮膚老化情況進行分值評估，這些標準有行業內公認的判定標準，如歐萊雅集團的皮膚老化分級圖譜、日本的眼部皺紋分級圖譜等；或者機構根據自己的經驗總結的一套成熟的、經過驗證的判定標準。臨床評估法主要用于目前儀器無法直接檢測分析的指標，或者輔助儀器測試進行評估分析，此方法的結果相對主觀，主要依靠于評估的人員主觀性感受和經驗性判斷。

2.3.2 圖像分析法：圖像分析主要是通過專業儀器采集測試部位的皮膚圖像，然后分析測試部位皮膚的老化特征，此方法既可以獲得直觀的皮膚變化的圖像，也可以通過軟件（Image-Pro Plus，IPP）分析獲得相對客觀的數據。目前圖像分析較多用于皮膚紋理和質地的分析，包括全臉和局部紋理，主要評估皮膚的粗糙度、皺紋的深度及長度等[1]。此外，圖像分析也可以用來評估皮膚顏色、紅區、斑點、毛孔等變化，可用于舒緩、祛斑、美白等功效的評估。

2.3.3 儀器分析法：儀器分析是直接使用皮膚測量儀檢測產品使用前后皮膚老化相關指標的變化。隨著皮膚老化，皮膚的含水量、屏障功能、彈性、膚色、皮膚的厚度和密度等都變得越來越差，這些指標變化都可以采用儀器測試進行量化體現[8]。含水量、屏障功能、彈性、膚色這些指標一直都是衰老評估的重要指標[9]，評估方法也相對比較成熟，可選擇的儀器也比較多。

皮膚厚度和密度是近年來發展起來的衰老的評估指標。皮膚的厚度和密度主要是通過高頻超聲儀進行測量，頻率范圍20～100 MHz，可觀察表皮、真皮、皮下組織上部以及附件和小血管[10]。低頻率可以到達皮膚較深的地方，圖片分辨率較低；高頻率可以觀察皮膚較淺的地方，圖像的分辨率較高。皮膚高頻超聲圖像分為三層：入口回聲（強回聲，角質層角化角質細胞），真皮回聲（彌漫回聲，根據測試位置膠原纖維數量和水化程度有不同的回聲），皮下組織回聲很低或無回聲。膠原纖維數量越多，組織回聲越強，細胞間質含量越高，回聲越低[10]。

皮膚各層厚度和回聲的變化與皮膚自然老化和光老化都有關。皮膚密度反映了真皮中膠原蛋白和彈性蛋白的水平，而皮膚厚度則反映了與年齡相關的皮膚變薄程度以及改善真皮結構的潛力[11]。年輕的皮膚呈現出更強的回聲和更均勻的厚度，反映了這層結構和角質細胞的完整性。隨著光老化、彈性蛋白變性、膠原纖維編織結構的變化和糖胺聚糖聚集導致表皮下低回聲帶（Subepidermal low echogenic band，SLEB）在真皮中形成。從真皮上部SLEB的存在和大小可以推斷光老化的嚴重程度，因此，SLEB可以作為判斷皮膚光老化的一個重要指標，隨著年齡的增長，低回聲帶的相對回聲強度降低，厚度增加[10，12]。

除了上述評估方法外，還有一些其他儀器也可以聯合使用來評估皮膚的老化。筆者實驗室2020年的一項研究發現，熒光光譜儀也可以用來在體檢測皮膚老化的情況。筆者單位采用熒光光譜分析儀FL7000分別采集了154名21～60歲女性受試者的光暴露部位和非暴露部位的晚期糖基化終末產物（Advanced glycation end products，AGEs）、類胡蘿卜素（Carotenoids）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和色氨酸（Tryptophan，Trp）這4個自身可發熒光，并與皮膚的自然老化和光老化密切相關的指標[13]。AGEs是糖基化的終產物，在內源性衰老的發生發展中起著重要作用，且與皮膚光老化也密切相關。類胡蘿卜素作為抗氧化劑可以保護皮膚，減少污染、紫外線輻射和氧化應激造成的皮膚損傷和老化[14]。色氨酸會隨著年齡的增長逐漸減少，可以反映皮膚的老化。通過分析這4個指標在不同年齡段、不同測試部位的數據，以未暴露部位的AGEs作為內在衰老的參數，類胡蘿卜素作為暴露部位的保護因子，NADH作為危險因子，色氨酸作為暴露部位光老化的指標，建立皮膚生理年齡指數。該指標綜合了內在衰老、光老化、危險因素和保護因素等指標，能較好地反映當前皮膚的生理年齡，預測衰老發展，為后續護膚品的開發和使用提供建議[15]。

2.3.4 臨床評估影響因素—配方劑型：抗衰老功效性的評估不僅與使用部位、使用頻率、使用周期、配方中活性物質的添加量等基本因素有關外，也與產品配方的特性有關。筆者實驗室近年的一項研究發現，單次使用后即刻，同樣同劑量活性物的水劑（Toner）、水包油（O/W）、油包水（W/O）、硅油包水（W/Si-O）配方對皮膚角質層含水量、紋理質地方面的改善存在較大的差異，數據結果顯示角質層含水量Toner＞O/W＞W/O＞W/Si-O，使用后2 h，O/W＞Toner＝W/O＞W/Si-O；而在皮膚質地改善方面，使用后即刻，W/O的改善效果最好，使用后2 h，O/W效果最好。分析這一結果猜測，即時皮膚含水量的改善與配方中水的比例有關，而長期效果則與水的比例和油脂的含量皆有關。W/Si-O體系對于皮膚含水量和改善細紋方面沒有明顯優勢，但其可以優化提升產品的使用膚感。在改善皮膚細紋方面，W/O配方即時效果最好，O/W則長期效果上表現更好。根據這一結果，我們認為產品的劑型對產品的功效有提升的作用，針對保濕功效宣稱的產品，O/W配方的效果可能會更好一些；而W/O配方則更適用于抗皺類的產品。因此，不同類型的配方在改善皮膚膚質方面效果存在一定的差異性，可以根據產品的目標功效宣稱，選擇合適的配方，以更好地達到改善肌膚的效果。同時，我們在設計產品的功效測試方案時，也應該根據產品的劑型選擇更為合適的測試指標和儀器來進行功效評估。

在體功效評估相對于體外評估和動物實驗更客觀準確，通過受試者直接使用，來檢測分析其實際應用效果，主要是用來篩選配方或產品的功效性；但其需要考慮的影響因素也比較多，如目標人群的選擇、使用部位、使用頻率、受試者的順應性、測試時間（季節因素等）、測試方法的選擇等。

抗衰老功效評估時，可以將體外和在體聯合應用，如在原料篩選中，可以選擇先采用體外評估方法進行高通量篩選獲得一個或幾個潛在的原料，后續再進行人體測試其臨床功效性，在臨床測試中，可以將圖像分析、臨床評估及儀器測試聯合使用，從多個維度評估可能的效果和獲得配方中的添加量的選擇。在產品測試中，也可以在人體臨床評估的基礎上，采用體外評估輔助獲得可能的作用機理和通路，為產品的宣稱提供機理性輔助，尤其是現在許多消費者比較注重產品的成分和皮膚學機理，即所謂的“成分黨”，這種組合評估的模式，既能滿足品牌方的產品功效宣稱需求，又能滿足消費者成分機理關注的心理。

3? 小結

隨著人們生活水平和生活質量的不斷提高，大家除了對日常基本的衣食住行關注之外，也提升了對面部容顏變化的關注。從古至今，“青春永駐”一直都是一個永恒的話題，抗衰老化妝品也越來越受到人們的關注與應用。因此，對這些產品功效評估方法的需求也在迅速增長。對于抗衰老的功效性評估，要根據實際需求，選擇合理的評估方法，可以選擇體外、在體相結合，或者多種在體評估方法聯合使用，挖掘產品功效的一切可能性，為產品的功效宣稱方向提供技術支持。同時，在現有的評估方法的基礎上，結合現代新的科學技術、皮膚科生理學發展，開發新的評估方法，為產品的開發和消費者的護膚選擇提供更多的方向。

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[收稿日期]2021-06-29

本文引用格式：宋姣，陳斌，秦燕，等.皮膚衰老評價方法的研究進展[J].中國美容醫學，2023，32（6）：203-205.