經典名方當歸補血湯物質基準的質量標準研究

謝曉林 李 娟 張德柱 馬 釗 梁承遠 凌 梅 喬乖萍 惠 楠

(1 陜西盤龍藥業集團股份有限公司,西安,710021; 2 陜西科技大學,西安,710021)

經典名方研究是國家推動中醫藥產業發展的重要手段,2018年國家公布的《古代經典名方目錄(第一批)》,掀起了經典名方的研究熱潮[1-3]。當歸補血湯是國家首批公布的經典名方之一,源自金元時期李東垣的《內外傷辯惑論》,是經典的補益劑[4]。其方為“黃芪一兩,當歸(酒洗)二錢。上件藥,口父咀,都作一服。水二盞,煎至一盞,去渣,溫服,空心食前。”方中黃芪大補肺脾之氣,以滋生化之源,當歸養血合營,二者合用,共奏益氣補血之效[5]。主治血虛陽浮發熱證,肌熱面紅,煩渴欲飲,脈洪大而虛,重按無力。亦治婦人經期、產后血虛發熱頭痛,或瘡瘍潰后久不愈合者[6]。現代研究還表明,當歸補血湯具有抗腫瘤、抗疲勞、抗炎、抗糖尿病、保肝、保護心腦血管等藥理作用[7-11]。此外,當歸補血湯療效確切、配伍簡單,是中藥復方制劑的研究熱點。

本研究參照《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則(試行)》中的部分要求[12],研究了當歸補血湯的基準樣品,包括當歸的炮制、藥材前處理、煎煮、濾過、干燥等工藝參數,進行了當歸補血湯基準樣品中阿魏酸以及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定以及基準樣品的薄層鑒別,為當歸補血湯基準樣品質量研究提供了科學依據,也為該經典名方研制成現代中藥復方制劑提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津公司,日本,型號:LC-16);電子天平(0.1 mg)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,瑞士,型號:LE204E/02];電子天平(0.01 g)(凱豐集團有限公司,型號:JCS-600);語盟牌超聲波清洗機(深圳市方奧微電子有限公司,型號:YM-100S);集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器設備有限公司,型號:DF-101S);數顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠,型號:HH-8);三用紫外分析儀(南京大衛儀器設備有限公司,型號:ZF-1);3L底盤加熱式煎藥壺(潮州市潮安區龍光電器有限公司,型號:30MF5)。

1.2 試劑與試藥 毛蕊異黃酮葡萄糖苷(南京春秋生物工程有限公司,批號:MRYG20200813);黃芪甲苷(南京春秋生物工程有限公司,批號:HQJG20190126);藁本內酯(上海安譜實驗科技股份有限公司,批號:91980008);阿魏酸(中國食品藥品檢定研究院,批號:110773-201915);色譜醇乙腈(Fisher Scientific,美國,批號:P2478474);色譜醇磷酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:H2110260);色譜醇甲醇(Fisher Scientific,美國,批號:P2470293);色譜級甲酸(麥克林,批號:G12966266);純凈水(陜西娃哈哈有限公司,貨號:6222SS07116),色譜醇無水乙醇(麥克林,批號:C14789359);其他試劑均為分析純,包括甲苯(西隴科學,批號:201029);乙酸乙酯(GENERAL-REAGENT,批號:G23272I);冰乙酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:G2121128);正丁醇(麥克林,批號:C14255485);三氯甲烷(浙化中星化工,批號:20201009)。

1.3 分析樣品 當歸補血湯處方藥材黃芪和當歸收集不少于3個產地,采集批次不低于15批,經檢驗,藥材質量符合最新版《中華人民共和國藥典》的標準[13]。將這15批黃芪和當歸藥材飲片進行分批組合,制備15批當歸補血湯物質基準樣品。見表1。

表1 15批當歸補血湯物質基準制備用藥材產地及批號

2 方法與結果

2.1 物質基準制備方法 根據《內外傷辨惑論》進行處方考證[4],查閱文獻典籍考證歷代度量衡的演變[14]。最終確定本方中一兩折合現代劑量約為30 g,二錢約為6 g,一盞約為200 mL。同時,通過對煎煮工藝的考察[15-17],最終確定物質基準制備方法為:稱取黃芪飲片30 g、酒洗當歸飲片6 g,共36 g,置煎藥鍋中,加水400 mL浸泡30 min,武火煎煮30 min,放冷,濾過。另加水200 mL,文火煎煮30 min,放冷,濾過。將2次煎液合并,冷凍干燥36 h。即得15批當歸補血湯物質基準樣品,編號為DGBXT01～DGBXT15。

2.2 薄層色譜法鑒別

2.2.1 當歸 稱取當歸補血湯物質基準樣品粉末0.2 g于250 mL具塞錐形瓶中,加入甲醇10 mL,密塞超聲提取1 h后取出,放冷、過濾,濾液水浴蒸干后加1 mL甲醇溶解,作為供試品溶液。另取炮制好的酒洗當歸藥材、當歸對照藥材以及阿魏酸和藁本內酯對照品適量,照2020版《中華人民共和國藥典(一部)》當歸項下鑒別法制備對照藥材溶液以及對照品溶液[13]。

展開方法:按2020版《中華人民共和國藥典·通則0502》薄層色譜法試驗[13],在同一硅膠G薄層板上,用毛細管取上述對照藥材及對照品溶液10 μL、供試品溶液15 μL依次點樣,將點好的薄層板放入裝有展開劑甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(9∶1∶0.2)的雙槽展開缸中,上行展開10 cm后取出薄層板,晾干,在365 nm紫外光燈下檢視。樣品與對照藥材以及對照品在相應的位置上呈現相同的熒光斑點。見圖1。

圖1 當歸的薄層色譜法鑒別注:1.阿魏酸對照品;2.藁本內酯對照品;3.當歸(酒洗)藥材;4.當歸對照藥材;5～9.樣品

2.2.2 黃芪 稱取當歸補血湯物質基準樣品粉末0.5 g于250 mL具塞錐形瓶中,加入高純水20 mL后超聲20 min使溶解,用水飽和的正丁醇溶液30 mL萃取2次,15 mL/次,棄去水液,將合并的正丁醇液用5%碳酸鈉溶液提取2次,15 mL/次,棄去水液,蒸干正丁醇液,用1 mL甲醇將剩余物溶解,以此為樣品溶液。另取黃芪藥材2 g,加水20 mL,加熱回流30 min,濾過,濾液同法萃取制備對照藥材溶液。稱取適量黃芪甲苷對照品,按照2020版《中華人民共和國藥典(一部)》黃芪項下鑒別法制備對照品溶液[13]。

展開方法:按薄層色譜法2020版《中華人民共和國藥典·通則0502》試驗[13],在同一硅膠G薄層板上,用毛細管吸取10 μL對照品溶液,20 μL對照藥材以及供試品溶液依次點樣,將點好的薄層板放入裝有展開劑三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的雙槽展開缸中,上行展開10 cm后取出薄層板,晾干后均勻噴上10%硫酸乙醇溶液,放入烘箱中,105 ℃加熱至有清晰的斑點顯現。樣品與對照藥材以及對照品在相應的位置上,日光下顯相同顏色的斑點;365 nm紫外光燈下顯相同的熒光斑點。見圖2。

圖2 黃芪的薄層色譜法鑒別注:1.黃芪甲苷對照品;2.黃芪對照藥材;3～7.樣品

2.3 阿魏酸的含量測定

2.3.1 色譜條件 使用Newmate TM C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈(A):0.2%甲酸(B)=20∶80為流動相等度洗脫,流速為0.5 mL/min;檢測波長:316 nm;進樣量:10 μL;柱溫:35 ℃。理論塔板數:按阿魏酸峰計算不得低于3 000。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品適量于容量瓶中,加乙醇溶解并定容,即得。

2.3.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備 精密稱取當歸補血湯物質基準樣品0.2 g于250 mL的具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇10 mL,密塞稱重,加熱回流提取1 h,放冷,用提取溶劑補足減失的重量后濾過,取續濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。精密稱取不含當歸的陰性對照樣品0.2 g,同法配制陰性對照溶液。

2.3.4 專屬性試驗 分別取上述3種溶液,按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析。見圖3。供試品色譜中與對照品色譜相應位置處有阿魏酸色譜峰,陰性樣品不干擾測定,雜質峰與阿魏酸峰分離度良好,該方法專屬性良好。

圖3 阿魏酸的專屬性試驗色譜圖注:A.阿魏酸對照品;B.樣品;C.缺當歸陰性樣品;峰1.阿魏酸

2.3.5 線性關系考察 取阿魏酸對照品10 mg,置50 mL容量瓶中,加乙醇制備200.00 μg/mL的母液。取一定量的母液于容量瓶中,分別加乙醇稀釋配制質量濃度為10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL的溶液。按“2.3.1”項下色譜條件測定,記錄峰面積,進行線性回歸。阿魏酸的線性方程為:Y=82 270.2X-379 574(r=0.999 5),表明阿魏酸在10～200 μg范圍內有良好的線性關系。

2.3.6 中間精密度試驗 取上述20 μg/mL的阿魏酸對照品溶液,按“2.3.1”項下色譜方法重復進樣6次,計算阿魏酸色譜峰面積相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)為1.71%,表明阿魏酸有良好的進樣精密度。

2.3.7 供試品溶液穩定性試驗 取同一供試品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定,得阿魏酸色譜峰面積RSD為2.32%,表明樣品24 h穩定性良好。

2.3.8 重復性試驗 取同一批當歸補血湯物質基準樣品,按“2.3.2”項下方法平行制備6份供試品溶液并按相應色譜條件進樣,記錄阿魏酸的色譜峰面積,計算含量以及RSD。結果測得阿魏酸的平均含量為0.418 1 mg/g,RSD為2.31%,表明有良好的重復性。

2.3.9 回收率試驗 取“2.3.8”項下的當歸補血湯物質基準樣品6份,0.2 g/份,精密稱定。分別加入100 μg的阿魏酸對照品,按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液,并按相應色譜條件進樣分析,計算回收率。阿魏酸的平均回收率為100.64%,RSD為2.87%,表明該方法回收率合格。見表2。

表2 加樣回收率結果(n=6)

2.3.10 樣品測定結果 取15批當歸補血湯物質基準樣品配制供試品溶液,按上述色譜條件進樣分析計算阿魏酸的含量。見表4。

2.4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定

2.4.1 色譜條件 使用Newmate TM C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈為流動相A,0.2%甲酸水溶液為流動相B。梯度洗脫(0～20 min,80%A→60%A;20～35 min,60%A),流速0.5 mL/min,檢測波長260 nm,進樣量10 μL,柱溫30 ℃。理論塔板數:按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算不得低于3 000。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量于容量瓶中,加甲醇溶解并定容即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取當歸補血湯物質基準樣品0.2 g于250 mL具塞錐形瓶中,精密量取10 mL甲醇,密塞稱重,超聲提取1 h,放冷,用提取溶劑補足減失的重量后濾過,取續濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾即得。精密稱取不含黃芪的陰性對照樣品0.2 g,同法制成陰性對照溶液。

2.4.4 專屬性試驗 分別取上述3種溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。供試品色譜中與對照品色譜相應位置處有毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰,陰性樣品不干擾測定。毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰與雜質峰分離度良好,表明方法有良好的專屬性。見圖4。

圖4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的專屬性試驗色譜圖注:D.毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品;E.樣品;F.無黃芪陰性樣品;2.毛蕊異黃酮葡萄糖苷

2.4.5 線性關系考察 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品5 mg于100 mL容量瓶中,加甲醇溶解制得50.00 μg/mL的母液。量取一定量的母液于容量瓶中,加甲醇溶解稀釋制備質量濃度分別為5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、40.00 μg/mL的溶液。按“2.4.1”項下的色譜條件測定,記錄峰面積,進行線性回歸。得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性方程為:Y=82 179.6X-257 13.2(r=0.999 9),毛蕊異黃酮葡萄糖苷在5～50 μg范圍線性關系良好。

2.4.6 中間精密度試驗 取濃度為50 μg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液,連續進樣6次,按上述色譜方法進行測定,RSD為0.46%,表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷的進樣精密度良好。

2.4.7 供試品溶液穩定性試驗 取同一供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣分析測定,得毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰面積RSD為1.94%,表明樣品室溫放置24 h穩定。

2.4.8 重復性試驗 取同一批當歸補血湯物質基準樣品,按“2.4.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣,記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜峰面積,計算含量以及RSD。結果測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量為0.555 4 mg/g,RSD為2.60%,表明重復性良好。

2.4.9 回收率試驗 取“2.4.8”項下6份當歸補血湯物質基準樣品,每份約0.2 g,精密稱定。分別加入50 μg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液2.4 mL,按“2.4.2”項下方法配制供試品溶液,按相應色譜條件分析測定,計算回收率。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均回收率為92.62%,RSD為1.85%,表明該方法有良好的加樣回收率。見表3。

表3 加樣回收率結果(n=6)

2.4.10 樣品測定結果 取15批當歸補血湯物質基準樣品制備供試品溶液,按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。15批樣品中2個待測成分阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別在0.068%～0.109%和0.057%～0.092%。見表4。

表4 樣品含量測定結果(%)

3 討論

3.1 薄層色譜法鑒別 本研究擬建立當歸補血湯中阿魏酸、藁本內酯、毛蕊異黃酮葡萄糖苷以及黃芪甲苷的薄層色譜法鑒別項,但毛蕊異黃酮葡萄糖苷斑點顯色不清晰,最終選擇阿魏酸和藁本內酯作為當歸的定性鑒別項,選擇黃芪甲苷作為黃芪的定性鑒別指標,建立的薄層色譜法鑒別方法中供試品制備方法簡單易操作,所選擇的展開劑對樣品的分離度良好,得到的斑點清晰,耐用性良好。

3.2 流動相以及流速的選擇 為了得到峰形良好,分離度良好的色譜峰,實驗中考察了不同的流動相體系,包括乙腈和水的體系、甲醇和水的體系,也考察了不同的改性劑如磷酸、甲酸對峰形的影響。結果表明以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相洗脫系統得到的色譜峰峰形較佳,且各成分分離情況相對較好,故最終選定乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相。實驗中還考察了0.5 mL/min、0.8 mL/min和1.0 mL/min的流速進行洗脫,結果以0.5 mL/min的流速得到的色譜峰峰面積最大。

3.3 樣品提取方法選擇 本實驗分別考察了不同體積分數的甲醇、乙醇以及水作為提取溶劑的提取效率。鑒于常用的提取方法為超聲提取和加熱回流提取,因此本實驗還考察了這2種提取方式的提取效果。結果表明用50%的乙醇回流1 h提取阿魏酸的效果最好。用甲醇超聲1 h和回流1 h提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷的效果無明顯區別,為了操作簡單,選擇用甲醇超聲1 h提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷。

3.4 小結 經典名方應用歷史久遠,各種共性、難點問題如處方考證、劑量換算、藥材炮制、湯劑煎煮方式以及時間等較為復雜,文獻考證并不能為所有問題提供確證性依據。因此,本實驗在崇經尚典的基本原則下,秉承“遵古不泥古”的理念,從發展的角度去認識經典名方復方制劑的研發。本實驗以古籍中記載的當歸補血湯制備方法為依據,結合劑型、容器的度量衡及現代通用方法綜合考慮來優化并確定最終的當歸補血湯物質基準的制備方案[18-22]。對不同批次的當歸補血湯物質基準進行質量標準研究,采用薄層色譜法和高壓液相色譜法,建立了當歸補血湯的定性鑒別和含量測定方法。該方法簡單、準確、穩定,為后續當歸補血相關制劑的研發以及質量標準研究奠定了基礎。

利益沖突聲明:無。