血清外泌體miR-496與HPV陽性口咽鱗狀細胞癌預后的相關性*

黃云竹，張福軍，舒治利，黎黎

隨著吸煙及飲酒人群占比降低，頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）的發(fā)病率逐漸下降，但口咽鱗狀細胞癌（OPSCC）的發(fā)病率卻呈上升趨勢[1]。OPSCC 主要影響老年人群，尤其對于患有心血管、內(nèi)分泌和肌肉骨骼疾病等合并癥的老年患者，治療決策尤其具有挑戰(zhàn)性[2]。高危人乳頭狀瘤病毒（HR-HPV）的持續(xù)感染被認為是OPSCC 發(fā)展的主要因素。例如HPV E6 和E7 癌蛋白分別與抑癌基因p53 和pRb 結合，導致其失活，從而破壞細胞增殖周期的正常調(diào)節(jié)，最終導致細胞永生化和持續(xù)惡性增殖[3]。最近的研究表明，E6 和E7 的異常增加可以調(diào)節(jié)微小RNA（miRNA）的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后[4]。HPV 陽性HNSCC 具有獨特的miRNA 圖譜，研究與E6 和E7 相關的miRNA，對于篩選一些潛在的OPSCC 治療靶點和生物標志物具有重要意義。miR-496 在各種腫瘤中異常調(diào)節(jié)，在癌癥發(fā)生中起重要作用[5-8]。據(jù)報道，miR-496 可被HPV-16 E6 癌蛋白下調(diào)，進而影響E2F 核轉(zhuǎn)錄因子2（E2F2）的轉(zhuǎn)錄后控制，E2F2 被證實是HNSCC中重要的促癌分子[8]。因此，我們推測miR-496可作為HPV 陽性OPSCC 的生物標志物。為了證實該推測，我們通過檢測了≥60 歲OPSCC 患者血清外泌體miR-496 表達水平以及腫瘤HPV 狀態(tài)，并進一步分析miR-496 與總生存率（OS）的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 在這項前瞻性隊列研究中，共納入2012 年1 月至2021 年12 月期間新診斷的≥60歲原發(fā)性OPSCC 患者119 例，男性77 例，女性42 例，年齡60～88(65.53±5.69)歲，包括84 例HPV 陽性患者和35 例HPV 陰性患者。納入標準：（1）通過術中快速病理檢查或內(nèi)鏡檢查診斷的原發(fā)性OPSCC；（2）年齡≥60 歲；（3）無手術、放療或化療史；（4）存檔組織庫中足夠的組織進行免疫組織化學染色。排除標準：（1）診斷時患有其他同時活動性惡性腫瘤或缺乏隨訪的患者；（2）血樣采集前1 個月內(nèi)的糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療史；（3）風濕性疾病、腎功能不全或透析，或肝/心力衰竭。收集人口統(tǒng)計資料（年齡、性別）、臨床病理學[吸煙史、飲酒史、TNM 分期、美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）分期、腫瘤位置、HPV 狀態(tài)、主要治療方式]。HPV 狀態(tài)是通過Smeets 算法結合p16 免疫組織化學法（IHC）檢測確定的，所有石蠟包埋的組織樣本都用p16-INK4a 抗體進行免疫染色，≥70%的腫瘤細胞為陽性則認為HPV 陽性。另外招募60 例健康個體作為對照，性別、年齡與OPSCC 患者相匹配（P ＞0.05）。該研究根據(jù)《赫爾辛基宣言》的指導方針進行，并得到當?shù)蒯t(yī)院機構審查委員會的批準。所有患者均獲得書面知情同意書。根據(jù)批準的研發(fā)方案完成數(shù)據(jù)分析。

1.2 血清外泌體的提取及鑒定 在任何治療之前，從每位參與者身上采集靜脈血（約5 mL），離心所有血液樣本，分離血清，并將分離的上清液儲存在-80℃下，直至進一步分析。分析前，血清在4℃下以3000 r/min 離心10min。然后用等體積的無菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋上清液，并在4℃下以10000 r/min 再次離心30min。所得上清液通過0.22μm 過濾器（美國Millipore）過濾，轉(zhuǎn)移至無菌超離心管，然后在4℃下以200000 r/min離心2h（Beckman Optima XE-90，美國Beckman Coulter）。為了進行胞外體純化，將顆粒洗滌后，在4℃下以200000 r/min 離心1h。在此步驟之后，收集含有外泌體的顆粒，將其重懸，用于后續(xù)研究。分離后，通過透射電子顯微鏡（TEM；Tecnai G2 Spirit TWIN；美國Thermo Fisher Scientific）觀察外泌體的超微結構、濃度和大小分布。為了進一步確定分離的外泌體的尺寸分布特征，使用ZetaView 納米粒子跟蹤分析儀（德國Particle Metrix）進行納米粒子跟蹤分析（NTA）。蛋白標記物如TSG101、CD9、CD63 通過Western blot 進行評估。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測miR-496 通過mirVana PARIS 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific）提取血清外泌體miRNA，提取的總miRNAs 的OD260/280 值在1.8 到2.0 之間。然后根據(jù)制造商（美國ThermoFisher）的方案，使用TaqManTM MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。使用Taqman?MicroRNA 分析（包括引物和探針，美國ThermoFisher）對外泌體miR-496 水平進行定量，并將miR-16 用作內(nèi)部對照。我們使用LightCyler?96 實時PCR 檢測系統(tǒng)（瑞士羅氏）進行所有PCR 反應。

1.4 隨訪觀察 所有OPSCC 患者治療后均以電話訪問或門診復查的方式進行隨訪。期間電話隨訪連續(xù)3 次失敗視為失訪。記錄患者的總生存期（OS）及無進展生存期（PFS），OS 定義為從治療開始到患者死亡或隨訪截止隨訪日期的時間間隔；PFS從治療開始到患者疾病進展、發(fā)生死亡或隨訪截止隨訪日期的時間間隔。

1.5 統(tǒng)計學方法 SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件被用于數(shù)據(jù)處理，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov 正態(tài)性檢驗，血清外泌體miR-496 表達水平不符合正態(tài)分布，以中位值和四分位值表示，進行Mann-WhitneyU 檢驗。計數(shù)資料以例（百分比）表示，進行卡方檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線以確定血清外泌體miR-496 的診斷價值。采用單因素及多因素COX 回歸分析影響HPV 陽性OPSCC 患者預后不良的臨床因素。繪制Kaplan-Meier 生存曲線，并對OPSCC患者中位生存時間進行Log Rank 2檢驗。P 值＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血清外泌體提取和鑒定 TEM 圖像顯示了外泌體的杯狀形態(tài)和雙膜囊泡狀結構，直徑為30-150nm。如NTA 所示，外泌體峰值直徑約為110nm。Western blot 分析表明，外泌體標記蛋白TSG101、CD63和CD9在外泌體樣本中呈陽性表達，而在外泌體缺失的上清液中沒有特異性條帶。這些結果表明，從血清中分離的小泡是外泌體（圖1）。

圖1 血清外泌體TEM 下觀察囊泡形態(tài)（49000×）和外泌體標志蛋白表達情況

2.2 OPSCC 患者血清外泌體miR-496 表達水平及其診斷價值 采用RT-qPCR 檢測，與健康受試者相比，HPV 陽性患者血清外泌體miR-496 表達水平均顯著下調(diào)[0.58（0.31，0.81）vs.1.08（0.75，1.33），P ＜0.05]，且低于HPV 陰性患者[0.58（0.31，0.81）vs.1.01（0.72，1.25），P ＜0.05]，但是HPV 陰性患者血清外泌體miR-496 表達水平與健康受試者相比無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）。經(jīng)ROC 曲線分析，血清外泌體miR-496 水平可以良好地區(qū)分HPV 陽性OPSCC 患者和健康受試者，AUC 值為0.918（95%CI：0.874 ～0.962），特異性和敏感性分別為79.80%和95.0%（圖2）。

圖2 ROC 曲線分析HPV 陽性OPSCC 患者血清外泌體miR-496 的診斷價值

2.3 血清外泌體miR-496 表達與HPV 陽性OPSCC患者臨床病理特征的關系 根據(jù)血清外泌體miR-496表達的中位值（0.58），將HPV 陽性OPSCC 患者分為低miR-496 表達亞組（≤0.58，n=42）及高miR-496 表達亞組（＞0.58，n=42）。經(jīng)分析，不同血清外泌體miR-496 表達亞組之間的診斷年齡、吸煙史、飲酒史、或治療方式等都沒有顯著差異（P ＞0.05），但是高miR-496表達亞組T分期更低（P＜0.05，表1）。

表1 血清外泌體miR-106a 表達與HPV 陽性OPSCC 患者臨床病理特征的關系

2.4 血清外泌體miR-496 表達與OPSCC 患者預后的關系

2.4.1 整體預后 本研究共有41 例患者發(fā)生疾病進展，38 例患者發(fā)生死亡。低miR-496 表達亞組OPSCC 患者的中位PFS 顯著低于高miR-496 表達亞組（25.3 個月vs.35.1 個月，2=4.245，P=0.039），但2 組的OS 中位值無顯著差異（27.8 個月vs.40.7 個月，2=0.027，P=0.870）（圖3A）。

圖3 血清外泌體miR-496 表達與（A）總體OPSCC 患者、（B）HPV 陽性OPSCC 患者、（C）HPV 陰性OPSCC患者預后的關系

2.4.2 HPV 陽性OPSCC 患者預后 HPV 陽性患者中，共有20 例患者發(fā)生疾病進展，15 例患者發(fā)生死亡。低miR-496 表達亞組HPV 陽性OPSCC 患者的中位PFS（27.6 個月vs.65.8 個月，2=11.448，P=0.001）、OS（29.5 個月vs.69.2 個月，2=6.948，P=0.008）均顯著低于高miR-496 表達亞組（圖3B）。

2.4.3 HPV 陰性OPSCC 患者預后 HPV 陰性患者中，共有21例患者發(fā)生疾病進展，23例患者發(fā)生死亡。低miR-496 表達亞組HPV 陰性OPSCC 患者的中位PFS（27.6個月vs.65.8個月，2=1.593，P=0.207）、OS（29.5個月vs.69.2 個月，2=0.013，P=0.909）均與高miR-496表達亞組無顯著差異（圖3C）。

2.5 單因素及多因素COX 分析影響HPV 陽性OPSCC 患者預后不良的臨床因素 經(jīng)單因素及多因素COX 分析，血清外泌體miR-496 表達水平降低是HPV 陽性OPSCC 患者疾病進展、死亡的獨立危險因素（P ＜0.05，表2，表3）。

表2 單因素及多因素COX 分析影響HPV 陽性OPSCC 患者PFS 的臨床因素

表3 單因素和多因素COX 分析影響HPV 陽性OPSCC 患者OS 的臨床因素

3 討 論

本研究是首次對OPSCC 患者血清外泌體中miR-496 表達進行分析，研究結果顯示，HPV 陽性OPSCC 患者血清外泌體miR-496 表達水平均較健康受試者和HPV 陰性患者高，ROC 曲線分析表明，血清外泌體miR-496 能夠以相對高的準確性區(qū)分HPV 陽性OPSCC 患者和健康受試者。最后，血清外泌體miR-496 水平被證實是HPV 陽性OPSCC患者的獨立預后指標。綜上所述，我們的結果表明miR-496 可能在HPV 陽性OPSCC 中作為一種癌癥相關miRNA 發(fā)揮作用。

HNSCC 是高度異質(zhì)性疾病，其發(fā)生、發(fā)展機制由遺傳、環(huán)境等因素共同影響[9]。HPV 相關癌癥的主要解剖部位是口咽，據(jù)報道，老年人群OPSCC的HPV 陽性率高達75%[1,10]。HPV16 已被確定為主要致病亞型，在過去二十年中，我國HPV16 陽性HNSCC 發(fā)病率有所增加[11]。盡管患病率和風險有所增加，但眾所周知，HPV 陽性患者的中位生存期明顯長于HPV 陰性患者[12]。已知HPV16 通過其兩種主要癌蛋白E7 和E6 的產(chǎn)生誘導細胞轉(zhuǎn)化，這兩種早期基因都可以改變腫瘤抑制因子視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb）和p53 的表達。生物信息學研究表明，超過一半的蛋白質(zhì)編碼基因受miRNA 控制，異常表達的miRNA 會破壞正常細胞中嚴格控制的RNA網(wǎng)絡，進而造成機體疾病狀態(tài)[13]。識別感興趣的腫瘤組織中差異表達的miRNA 是揭示癌癥發(fā)病機新分子機制的第一步。

既往的研究已經(jīng)證實，特異性miRNA 的失調(diào)可能在HNSCC 的發(fā)展中起著至關重要的作用[14]，外泌體在細胞之間可傳遞多種生物活性分子，從而參與多種生物學進程，包括腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和化學抗性[15]。因外泌體良好的結構穩(wěn)定性及生物學特性，本研究主要分析了血清外泌體miR-496 表達的生物學作用。最近，發(fā)現(xiàn)miR-496 在癌癥的進展中起著關鍵作用，例如在肺腺癌[5]、胃癌[6]、結腸癌[16]中miR-496 呈高表達。miR-496 通過抑制Ras 關聯(lián)結構域家族成員6（RASSF6）的表達，隨后促進結腸癌細胞Wnt 信號激活以及細胞增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。然而，miR-496 在口腔鱗狀細胞癌中表現(xiàn)出不同的作用。Mason 等[8]通過對HPV16陽性和HPV16 陰性口咽癌進行了全基因組miRNA篩選，使用嚴格的閾值，在HPV 陽性癌癥中發(fā)現(xiàn)13 種miRNA 被解除調(diào)控，其中包括miR-496。此外，對于HPV16 復制至關重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F2 直接受miR-496 水平的影響。E2F2 是E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族的一部分，與pRb 蛋白相互作用以促進腫瘤細胞的增殖[17]。pRb 通過與HPV 癌蛋白相互作用的降解釋放E2F，允許DNA 復制所需的蛋白質(zhì)的募集，從而通過反饋環(huán)導致p16 的過度表達。有趣的是，上調(diào)miR-496 表達可顯著抑制E2F2 mRNA 表達，雙熒光素酶報告基因結果也顯示，當共轉(zhuǎn)染miR-496 模擬物時，熒光素酶活性顯著降低30%，說明miR-496對口咽癌細胞中E2F2 的表達起轉(zhuǎn)錄后控制作用。因此，miR-496 在癌癥發(fā)展中的功能似乎是組織或細胞特異性的。上述機制可解釋本研究中低miR-496 表達亞組HPV 陽性OPSCC 患者的中位PFS 和OS 顯著低于高miR-496 表達亞組的原因[8]。

對于這項觀察性回顧性研究，需要考慮偏差或混雜因素對結果的潛在影響。研究人群中的患者均來自同一家醫(yī)院，主要有吸煙和飲酒史。HPV 陽性和陰性患者之間生活方式、治療方案和系統(tǒng)差異不是本研究分析的因素，但這些因素可能是OS 的影響因子。同樣，接受手術作為唯一治療方式的患者的疾病分期較低，因此，單獨手術與其他治療方式的比較在生存分析中存在偏差。這些都是本研究的局限性所在，我們希望在將來的工作中可以進一步完善或校正這些偏差。

總之，我們發(fā)現(xiàn)≥60 歲HPV 陽性OPSCC 患者血清外泌體miR-496 表達顯著上調(diào)，且在區(qū)分HPV陽性OPSCC 患者與健康受試者方面具有良好的靈敏度和特異性。此外，血清外泌體miR-496 表達不足與HPV 陽性OPSCC 患者更差的臨床結局和更短的生存期密切相關。因此，血清外泌體miR-496 可作為HPV 陽性OPSCC 患者診斷和預后的一個有前景的標志物。