鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理對四種小漿果反復冷凍融化品質的影響

謝浩鵬，劉幫迪，郭雪霞，焦文曉，趙韓棟，江利華

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038；2.農業農村部規劃設計研究院，北京 100125；3.農業農村部產地初加工重點實驗室，北京 100121；4.齊魯工業大學食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

小漿果泛指果實較小且多汁的一類由子房或聯合其他花器發育成柔軟多汁的小型肉質果，主要包括草莓、藍莓、樹莓、枸杞、黑加侖、沙棘等。由于它們普遍含有較高的生物活性物質并且具有獨特的酸甜口味，逐漸成為食品加工業的熱門果蔬加工原料[1]。隨著市場需求量的增大，我國小漿果已經逐漸從局部種植的特色水果變成大面積推廣的主要經濟作物。但小漿果產收季節較為集中，采收時受夏秋季高溫影響，采后呼吸作用、果實表皮水分殘留和微生物均易導致果實腐爛，貯藏周期極短[2]。因此全年加工的小漿果企業需要對漿果原料進行冷凍貯藏，以此來最大限度地保持原料品質。

然而，目前-20 ℃傳統冷凍和-38 ℃以下低溫速凍兩種冷凍技術雖然能夠達到延長果蔬原料貯藏期的目的，但由于果蔬細胞含水量高，緩速冷凍和低溫速凍過快均會對細胞造成不可逆的機械損傷，造成融化后的果實外觀品質劣變和生物活性物質損失[3-5]。滲透脫水冷凍（Osmotic-dehydration freezing）作為一種新型果蔬冷凍技術，能通過降低水分含量提高凍結速率，減少大型尖狀冰晶形成，保護物料的組織結構，進而減緩理化品質的下降[6-7]。但若使用不當，脫水預處理的小漿果在冷凍融化后仍然存在質地、色澤劣變和生物活性物質被破壞的問題。因此亟需將其他提升果蔬品質的技術協同應用于脫水冷凍，以提升小漿果的貯藏品質。

在發酵、干燥等果蔬加工領域大量研究表明，鈣鹽處理能夠靶向性地提升果蔬質地品質。鈣鹽進入果蔬細胞后，可以與果蔬細胞內的果膠相結合，形成以氫鍵相連的果膠鈣物質，穩定果蔬細胞壁結構，抵抗在加工過程中由理化因素導致的果蔬質地癱軟現象。因此，將鈣鹽處理與糖溶液滲透脫水冷凍技術相結合，有助于保護小漿果的細胞壁結構，緩解冷凍解凍對小漿果的破壞。

本研究以4種小漿果為試材，研究鈣鹽結合糖溶液滲透脫水技術對4 種小漿果反復凍融后品質的影響，以期為解決果蔬冷凍加工行業中，藍莓、草莓、枸杞、沙棘等小漿果原料貯藏時不耐冷凍問題提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

藍莓：品種為藍豐藍莓，購于山東煙臺；草莓：品種為紅顏草莓，購于北京；沙棘：品種為中國沙棘，購于山西呂梁；枸杞：品種為寧夏枸杞，購于寧夏中寧。

果糖-葡萄糖溶液，廣州雙橋有限公司；抗壞血酸檢測試劑盒、植物總酚檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；碳酸鈣、氯化鈣、丙酸鈣均為食品級，河南萬邦實業有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、愈創木酚、Triton X-100、過氧化氫溶液、磷酸二氫鈉、鄰苯二酚、二硫蘇糖醇（DTT）均為分析純，北京試劑有限公司；無水乙醇、冰乙酸均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

LQ-C5002 實驗室精密電子天平，深圳市飛亞衡器有限公司；TGL-16gR 高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；Rapid-TA質構儀，上海騰拔儀器科技有限公司；UV-2100 紫外可見分光光度計，上海化科實驗器材有限公司；DNM-9602 型酶標儀，普朗醫藥儀器有限公司；DW-86L388J 低溫保存冰箱，青島海爾醫療股份有限公司；BC/BD-300DT調溫冷藏箱，美菱股份有限公司；A11 basic 液氮研磨機，廣州IKA 公司；DDS-11A 型電導儀，上海鵬順科學儀器有限公司；THZ-C 恒溫振蕩器，豪城實驗儀器制造有限公司；NR110色差儀，3NH科技有限公司；Nikon D800相機，日本尼康公司；HH-6數碼恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市熔化儀器制造有限公司，KQ5200E超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備及處理

糖溶液的制備：將含糖量85%（質量分數）的果糖-葡萄糖漿加入適量的水稀釋至含糖量65%。

鈣鹽果糖-葡萄糖混合溶液制備：分別添加等量的氯化鈣、碳酸鈣、丙酸鈣于上述含糖量65%的果糖-葡萄糖溶液中，使鈣離子的質量濃度為15 g/L。

選擇低成熟度、大小一致、外觀無機械損傷的藍莓、草莓、枸杞和沙棘果實，挑選完的果實經清水洗凈、瀝干待用。試驗設置3 個組：普通緩凍組（CK組），糖溶液滲透脫水凍結處理組，鈣鹽結合糖溶液滲透脫水凍結處理組。

普通緩凍組（CK）：將新鮮藍莓、草莓、枸杞、沙棘果實用0.03 mm厚聚乙烯包裝袋（20 cm×14 cm）密封包裝后置于-18 ℃冰箱冷凍。每袋果實300 g，每種果實3袋，下同。

糖溶液滲透脫水凍結（Sugar osmosis dehydration，SOD）處理組：使用針頭對單個新鮮藍莓、草莓、枸杞、沙棘進行穿刺（針頭型號為4.5 號）。藍莓、草莓、枸杞每個果實穿刺3個孔，深度為3 mm左右，沙棘每個果實穿刺1～2個孔，深度為1 mm，然后將其以料液比1∶3（g/mL）的比例置于含糖量65%的果糖-葡萄糖溶液中滲透脫水6 h（滲透脫水條件為前期預試驗結果），然后用蒸餾水清洗果實表面糖溶液，并用紙巾拭干表面水分，之后用聚乙烯包裝袋密封包裝后放入-18 ℃冰箱中保存。

鈣鹽結合糖溶液滲透脫水凍結（Sugar osmosis dehydration-calcium，SOD-Ca）處理組：使用與SOD組相同的處理方法將新鮮藍莓、草莓、枸杞和沙棘穿刺后，將果實置于鈣離子質量濃度為15 g/L的鈣鹽果糖-葡萄糖溶液（樣品和滲透溶液的比例為1∶3（g/mL））中滲透脫水6 h，完成后用蒸餾水清洗果實表面糖溶液，并用紙巾小心拭干表面水分，之后用聚乙烯包裝袋密封包裝后放入-18 ℃冰箱中保存。

凍融處理方法：將分裝好的藍莓、草莓、枸杞、沙棘4種果實置于-18 ℃的冰箱中貯藏3 d，取出后在室溫（25±0.5）℃條件下解凍12 h，作為1 次凍融，再放回-18 ℃下進行冷凍貯藏，重復上述步驟，共凍融3次，并分別在凍融1、2、3次后取樣測定相關指標。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 硬度

參照Liu 等[8]的方法，使用質構儀測定。將果實置于質構儀平臺上，采用P/38 平板圓柱探頭對試樣進行TPA 測試。測試參數為：檢測速度10 mm/min，壓縮程度30%，起始力0.5 N。

1.2.2.2 色澤

參照劉幫迪等[9]的方法，使用色差儀對不同組別樣品的L*、a*、b*值進行測定。其中L*代表亮度值，a*代表紅綠值，b*代表黃藍值。每組樣品隨機選取10個果實測定，結果取平均值。

1.2.2.3 汁液流失率及相對電導率

參照馮欣欣等[10]的方法進行測定和計算。

1.2.2.4 總酚和抗壞血酸含量

參考Feng 等[11]的方法，使用南京建成生物工程研究所的檢測試劑盒進行測定。總酚和抗壞血酸含量單位分別為μmol/g和μg/mL。

1.2.2.5 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性和過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性

參照劉幫迪等[12]的方法，略作修改。以每克鮮重果實樣品每分鐘吸光度變化值增加1 為1 個PPO活性單位（U），以每克鮮重果實樣品每分鐘吸光度變化值增加1 為1 個POD 活性單位（U）。重復測定3 次，取平均值。

1.2.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2019 軟件對數據進行處理，SPSS 22.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鈣鹽協同糖溶液滲透脫水技術對四種小漿果反復冷凍融化后外觀品質的影響

2.1.1 四種小漿果反復凍融后的外觀變化

4種小漿果經過3次凍融循環后，外觀出現明顯變化，隨著凍融循環次數的增加，草莓、藍莓、枸杞和沙棘的果皮和果肉色澤均逐漸加深且果實皺縮程度逐漸增大，尤其在第3次凍融循環后最為嚴重。這是由于冰晶破壞了細胞結構，造成汁液流失使細胞失水，且果實和果皮暴露在空氣中被氧化，造成褐變現象的發生[13]。SOD組和SOD-Ca組果實經過凍融循環后，外觀狀態均優于CK組，且SOD-Ca組優于SOD組，說明糖溶液滲透脫水處理和鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理對上述4種小漿果的外觀品質均能起到較好的保護作用。

2.1.2 四種小漿果反復凍融后硬度的變化

硬度是反映果實凍融后品質的主要指標[14]。由圖1 可知，隨著凍融循環次數的增加，各組果實硬度呈現下降趨勢。在冷凍過程中，小漿果胞內自由水凍結后產生的大冰晶會對細胞造成機械損傷，導致解凍后的草莓、藍莓、枸杞和沙棘的硬度下降[15]。在第1 次和第2 次凍融循環中，SOD 組和SOD-Ca 組果實硬度顯著高于CK 組（P＜0.05），且SOD-Ca 組硬度顯著高于SOD組（P＜0.05）。這可能是由于滲透脫水處理使小漿果的水分含量降低，減少了冰晶對細胞結構的損傷，從而使果實保持較好的硬度。在第3次凍融循環后，草莓和沙棘SOD-Ca組與SOD組硬度值無顯著差異，這是因為隨著凍融次數的增加，冰晶損傷對漿果細胞破壞程度逐漸加深，細胞壁破壞程度嚴重，無法起到支撐細胞強度的作用，導致SOD-Ca組與SOD組的果實硬度下降到相同水平。研究結果說明，鈣鹽結合糖溶液滲透脫水凍結處理可在一定程度上提高細胞支撐強度，起到維持果實硬度的作用。但糖溶液滲透脫水處理和鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理對3 次以上凍融循環的果實均無法起到緩解其凍融損傷的作用。

圖1 脫水處理方式對草莓（A）、藍莓（B）、枸杞（C）、沙棘（D）反復凍融后硬度的影響Fig.1 Effects of three dewatering treatments on the hardness of strawberry(A),blueberry(B),wolfberry(C)and sea buckthorn(D)after three freeze-thaw cycles

2.1.3 四種小漿果反復凍融循環后色澤的變化

色澤是判斷果實成熟度以及果實品質的重要指標之一[16]。L*值表示果實的亮度，a*值表示紅綠值，由負值到正值表示果皮顏色由綠色到紅色的轉變，b*值表示黃藍值，由負值到正值表示果皮顏色由藍色到黃色的轉變。如表1 所示，隨著凍融循環次數的增加，草莓、藍莓、枸杞和沙棘L*值逐漸降低。可能是由于小漿果在凍結過程形成冰晶而造成細胞損傷，使酶與底物接觸而導致果實發生褐變。CK組L*值顯著低于SOD 組和SOD-Ca 組（P＜0.05），SOD-Ca 組L*值最高，說明兩種處理均可有效抑制果實褐變，維持果實色澤穩定，且鈣鹽結合糖液滲透脫水處理效果優于糖溶液滲透脫水。

表1 脫水處理方式對草莓、藍莓、枸杞、沙棘反復凍融后色澤的影響Table 1 Effect of dewatering treatment on color of strawberry,blueberry,wolfberry and sea buckthorn after three freeze-thaw cycles

2.2 鈣鹽協同糖溶液滲透脫水技術對四種小漿果反復冷凍融化后細胞破壞程度的影響

汁液流失現象是水果、蔬菜、畜產、水產等農產品原料在冷凍融化后均會出現的劣變現象，其極大地影響了農產品的商品銷售性和加工性[17-18]。小漿果是一種典型的高水分含量水果，其凍融后的汁液流失現象比其他水果更加嚴重。如圖2所示，在3次凍融循環過程中，草莓、藍莓、枸杞和沙棘的汁液流失率均逐漸升高，并且在每一次凍融循環中，4 種小漿果CK 的汁液流失率均最高，說明SOD 和SOD-Ca處理均能起到降低果實汁液流失率的作用。這可能是因為溶液中的糖分子進入細胞后，對組織中的水分子起到了一定的束縛作用，增強了小漿果的持水力。此外鈣離子也能與細胞壁上的果膠酸結合形成果膠酸鈣，并對其起到一定的保護作用，從而維持了細胞壁的結構，降低了汁液流失率[19]。第3次凍融循環后，SOD-Ca 組的草莓、藍莓和枸杞汁液流失率最低，分別為13.8%、23.1%、25.6%。說明SOD-Ca 處理對抑制小漿果汁液流失的效果最佳。這一結果與硬度相對應，鈣通過與果膠分子中帶負電荷的羧酸基團結合形成的“鈣橋”結構對細胞壁有一定的支撐作用，從而降低了汁液流失率，提高了果實硬度。

圖2 脫水處理方式對草莓（A）、藍莓（B）、枸杞（C）、沙棘（D）反復凍融后汁液流失的影響Fig.2 Effects of three dewatering treatments on juice loss of strawberry(A),blueberry(B),wolfberry(C)and sea buckthorn(D)after three freeze-thaw cycles

相對電導率反映果蔬組織細胞內電解質的滲漏情況。果蔬細胞組織受損后，會導致細胞膜內的電解質出現外滲現象，導致相對電導率上升[20]。4 種小漿果在反復凍融中相對電導率變化與細胞膜透性變化相似。如圖3 所示，3 次凍融循環過程中，各組草莓、藍莓、枸杞和沙棘相對電導率均持續上升，CK 組始終顯著高于SOD組和SOD-Ca 組（P＜0.05）。鈣鹽處理可減輕冷凍貯藏過程中冰晶造成的細胞膜損傷，維持細胞的完整性和功能性，從而保護解凍后果蔬的品質，故鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理效果優于糖溶液滲透脫水，其減輕了細胞冰晶損傷，更好地保護了細胞膜結構。SOD-Ca組與SOD組的沙棘果實間相對電導率無明顯差異，說明鈣鹽滲透脫水處理僅可對部分小漿果起到保護細胞，維持結構完整的作用。

2.3 鈣鹽協同糖溶液滲透脫水技術對四種小漿果反復冷凍融化后生物活性物質的影響

小漿果富含花青素、抗壞血酸、多糖和黃酮類物質，是重要的植物源功能性食品開發的原料之一[21-25]。抗壞血酸為還原劑，具有強抗氧化性，但由于在果蔬加工過程中較容易損失，因此抗壞血酸是衡量果實抗氧化品質和生物活性的最重要指標。由圖4可知，隨著凍融循環次數的增加，各組小漿果抗壞血酸含量均逐漸降低。CK組抗壞血酸含量始終顯著低于SOD 組和SOD-Ca 組（P＜0.05），SOD-Ca 組抗壞血酸含量最高。結果表明，鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理與糖溶液滲透脫水處理相比可更有效維持解凍后小漿果的抗壞血酸含量。這可能是由于鈣離子對細胞壁的作用，延緩了細胞中酶促反應的進行，從而保護了抗壞血酸免受氧化。與凍融循環1次相比，SOD-Ca組的草莓、藍莓、枸杞和沙棘抗壞血酸含量在第3次凍融循環后分別減少22.4%、31.5%、23.7%和32.2%，這可能是由于藍莓、沙棘的含水量更高，冰晶造成了更大的細胞損傷，導致凍融過程中抗壞血酸大量損失。

圖4 脫水處理方式對草莓（A）、藍莓（B）、枸杞（C）、沙棘（D）反復凍融后抗壞血酸含量的影響Fig.4 Effects of three dehydration treatments on ascorbic acid content of strawberry(A),blueberry(B),wolfberry(C)and sea buckthorn(D)after three freeze-thaw cycles

果實中酚類物質具有多種生理活性，影響著果實的色澤風味和營養品質[26]。如圖5 所示，在3 次凍融循環中，各組草莓、藍莓和沙棘3 種小漿果的總酚含量均呈先升高后降低的趨勢，而枸杞的總酚含量呈逐漸下降的趨勢。3 種小漿果前兩次凍融后酚類物質增加可能是由于一些結合態酚類物質在冰晶破壞下，隨汁液流失析出，短暫增加了酚類物質的可檢測值[27]。凍融導致枸杞中酚類化合物濃度下降可能是由于枸杞內PPO 和POD 活性增強，酚類物質氧化導致總酚含量減少[28]。SOD組和SOD-Ca組果實總酚含量顯著高于CK組（P＜0.05），說明兩種處理均能抑制凍融循環過程中4種小漿果酚類物質的損失，且第1 次凍融循環結束時，除枸杞外，其余3 種小漿果SOD-Ca 組的總酚含量均高于SOD 組，說明在1 次凍融循環處理下，鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理優于糖溶液滲透脫水處理，對果實總酚含量有更好的維持效果。

圖5 脫水處理方式對草莓（A）、藍莓（B）、枸杞（C）、沙棘（D）反復凍融后總酚含量的影響Fig.5 Effects of three dehydration treatments on total phenol content of strawberry(A),blueberry(B),wolfberry(C)and sea buckthorn(D)after three freeze-thaw cycles

2.4 鈣鹽協同糖溶液滲透脫水技術對四種小漿果反復冷凍融化后POD活性和PPO活性的影響

多酚氧化酶和過氧化物酶是引起果蔬酶促褐變的關鍵酶，也是果蔬加工過程中需要進行酶活性抑制的指示性酶。果蔬在加工前，常利用漂燙、熱蒸汽等方法對POD和PPO等與氧化相關的酶類進行鈍化處理，以保持果蔬品質[29-30]。如圖6和圖7所示，隨著凍融循環次數的增加，各組草莓、藍莓、枸杞和沙棘POD 和PPO 活性均隨凍融次數增加逐漸升高。反復冷凍融化過程會嚴重損傷漿果細胞，導致原本處于細胞器中的酶從組織中滲出，大量接觸氧氣、底物，從而激活PPO和POD等酶活性[27]。SOD組和SOD-Ca組果實的PPO和POD活性始終顯著低于CK組（P＜0.05），且SOD-Ca處理可以更有效地降低POD和PPO活性。綜上，鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理可有效抑制4種小漿果的PPO和POD活性，保持細胞完整性，維持果實色澤，提升果實貯藏品質和食用價值。

圖6 脫水處理方式對草莓（A）、藍莓（B）、枸杞（C）、沙棘（D）反復凍融后多酚氧化酶活性的影響Fig.6 Effects of three dewatering treatments on polyphenol oxidase activity of strawberry(A),blueberry(B),wolfberry(C)and sea buckthorn(D)after three freeze-thaw cycles

圖7 脫水處理方式對草莓（A）、藍莓（B）、枸杞（C）、沙棘（D）反復凍融后過氧化物酶活性的影響Fig.7 Effects of dewatering treatments on peroxidase activity of strawberry(A),blueberry(B),wolfberry(C)and sea buckthorn(D)after three freeze-thaw cycles

3 結論

本研究發現，通過鈣鹽結合糖溶液滲透脫水和糖溶液滲透脫水處理后的草莓、藍莓、枸杞和沙棘4種小漿果經過3次凍融循環后，其各項品質指標均優于普通緩凍組，且鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理效果最佳，可顯著降低4種小漿果的細胞膜透性和汁液流失，維持小漿果硬度，同時減少了4 種小漿果的抗壞血酸和酚類等生物活性物質的損失。在第2 次凍融循環后，草莓、藍莓和枸杞的總酚含量有一個明顯的增長，這可能是因為隨著凍融循環次數的增加，3種小漿果受到更大的冷凍脅迫，環境刺激果實自身產生更多酚類物質，以減少自身氧化損傷所致。另外，鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理還可有效抑制4種小漿果的多酚氧化酶和過氧化物酶活性，減少果實暴露在空氣中所發生的酶促褐變和氧化損傷，維持小漿果加工和營養品質。但在前兩次凍融循環中，鈣鹽結合糖溶液滲透脫水處理可有效提升漿果質地品質，但在第3次凍融循環后，SOD組和SOD-Ca組之間無顯著差異，這可能是冰晶對漿果細胞過度破壞造成的。本研究將鈣鹽處理和滲透脫水兩種果蔬貯藏技術有機結合，為解決小漿果原料不耐冷凍提供了技術支撐和理論依據。