葛根黃酮的閃式提取工藝及其保肝作用研究

丁昱嬋，秦令祥,*，丁艷芳，高愿軍

（1.漯河食品職業學院，河南 漯河 462300；2.漯河市食品研究院有限公司，河南 漯河 462300；3.河南和生食品有限公司，河南 漯河 462300；4.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

葛根又名葛藤、粉葛藤等，為豆科植物野葛的干燥根[1-2]，素有“亞洲人參”的美譽[3]，在我國有悠久的入藥歷史[4]。葛根中含有碳水化合物、蛋白質、膳食纖維等多種營養物質，以及三萜類、黃酮類、生物堿類等生物活性物質，此外還含有多種微量元素和氨基酸等[5-6]。黃酮類物質達30余種，主要為葛根素、金雀異黃素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和香豆素，其中葛根黃酮是葛根中的一種生物活性物質，具有抗腫瘤、抗氧化、改善血液循環、降血糖、降血脂和提高免疫力等多種功效[7-13]。

目前，葛根黃酮提取方法主要有：乙醇回流法[14]、復合酶法[15]、超聲輔助法[16]、微波法[17]等，這些方法各有優缺點。目前，閃式提取法[18]是一種新型提取方法，它是利用閃提器內刀刃間形成的超速動態分子滲透、高剪切和強力攪拌振動作用，迅速破壞植物細胞，使其細胞內的功能成分溶出，達到高效提取功能成分的作用，具有提取時間短、效率高、能耗低等顯著特點[19-20]。因此，本文采用閃式提取法提取葛根黃酮，通過正交試驗優化提取工藝，并對其解酒保肝作用進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

葛根：漯河張仲景大藥房；蘆丁（分析標準品，97%）：廣州分析測試中心科力技術開發公司；SPF級小鼠：實驗動物許可證號為SCXK(豫）-2020-0005，證書編號為C57BL/6j，體重（20±2）g，河南斯克貝斯生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、無水磷酸氫二鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉：均為分析純；聯苯雙酯、四氯化碳：鄭州化學試劑廠；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：上海經科化學科技有限公司；AB-8型大孔樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

Quintix 224-ICN電子分析天平，鄭州萊博儀器設備有限公司；WK-400B小型高速粉碎機，濟南博創制藥設備有限公司；HH-4D 型單獨控溫四孔數顯水浴鍋，DZF-6020AB 真空干燥箱，北京中興偉業世紀儀器有限公司；EV4000 VAC 型旋轉蒸發儀，上海常豫儀器有限公司；JHBE-50T 閃式提取器，河南智晶生物科技有限公司；UV2600 型雙光束紫外可見分光光度計，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

參照趙成萍等[21]的方法，并加以改進：準確稱取0.100 0 g 蘆丁，加入體積分數為95%的乙醇溶解、搖勻，并定容至1 000 mL，制成0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。取刻度為10 mL的試管6支，分別用編號1、2、3、4、5、6 標記，然后分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標準溶液。依次加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL和10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，靜置15 min，最后用95%的乙醇定容至10 mL。在波長510 nm 處測其吸光度，繪制蘆丁標準曲線，得到回歸方程。

1.2.2 葛根黃酮的提取及其得率測定

參照龔頻等[22]的方法提取及測定葛根黃酮得率。準確稱取粉碎后的葛根10 g 于錐形瓶中，以95%的乙醇作溶劑，分別在不同料液比、提取時間、提取次數和提取壓力的條件下進行閃式提取。提取完成后，在5 000 r/min 的條件下離心20 min，然后取其上清液并濃縮，再用AB-8型大孔樹脂純化[23]，最后將其真空干燥即可得到葛根黃酮。并按照“1.2.1”的方法測定吸光度，葛根黃酮得率計算公式如下：

式中：V為葛根黃酮提取液的體積，mL；C為標準曲線回歸方程得到的葛根黃酮質量濃度，mg/mL；m為葛根樣品質量，mg。

1.2.3 單因素試驗設計

以葛根黃酮得率為考察指標，按照“1.2.2”中的方法進行提取，在預試驗的基礎上，設定固定條件：提取電壓150 V，提取時間90 s，提取次數2次，料液比1∶25（g/mL），考察不同提取電壓（120、130、140、150、160 V）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））、提取時間（60、70、80、90、100 s）和提取次數（1、2、3、4、5 次）對葛根黃酮得率的影響，然后按“1.2.2”的方法測定并計算其得率。

1.2.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上優化提取條件，進行L9(34)正交試驗，試驗因素水平見表1。

綜合來看，隨著網絡信息技術的不斷發展，線上服務和線下服務的融合兼并，基于互聯網構建的交易平臺對消費者和服務提供者具體應該承擔的責任范圍和責任內容還有待商榷。把包含人身從屬性質、但又包含其自身特殊性的用工關系歸入法律范圍，并利用法律武器加以保護，這也是對現代法治社會、現代法治文明的有力體現。同時擴大勞動關系界定標準，對其概念加以宏觀闡釋，可以使傳統的勞動合同制更加適應不斷發展演變的新時代要求。而對網約車平臺和駕駛員兩間的法律關系和責任的明確界定，不僅可以加強對駕駛員行為的監管約束，也可以凈化服務環境，優化服務質量，進一步規范網約車行業以良好態勢發展。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 模型建立的方法

將40 只SPF 級雄性小鼠，飼養于溫度（26±2）℃，濕度50%～60%，噪音60分貝以下，照明12 h（每日8：00開燈，20：00關燈）的動物房內，喂養7 d后，隨機分為4組，分別為：正常對照組、CCl4對照組（CCl4誘導小鼠肝損傷可稱為模型組）、聯苯雙酯組(聯苯雙酯治療肝損傷，可稱為陽性對照組）、葛根黃酮提取液試驗組，每組10只。正常對照組和CCl4對照組每天均灌胃等體積的生理鹽水。聯苯雙酯組每天灌胃200 mg/kg聯苯雙酯，葛根黃酮提取液試驗組每天灌胃300 mg/kg葛根黃酮提取液（劑量參照《中華人民共和國藥典》[24]）。每天灌服1 次，共灌服7 d。在末次灌服2 h后，除正常對照組外，其他組均按10 mL/kg 腹腔注射0.1%的CCl4。小鼠禁食16 h后測定各指標。

1.2.6 小鼠生化指標的測定

末次灌服后禁食16 h，取小鼠眼球血，然后離心分離血清，離心條件為：4 ℃，4 000 r/min，20 min，然后測定血清中ALT、AST活性和MDA含量。同時，取小鼠肝組織，置于-70 ℃下，冷凍待用。按肝組織質量∶生理鹽水體積＝1∶9（g/mL）的比例混合，制成10%肝組織勻漿。并測定肝組織中SOD 和GSH-Px 活性。血清中ALT、AST 活性和MDA 含量及肝組織中SOD和GSH-Px活性測定均按試劑盒操作說明書操作。

1.2.7 數據處理

每組試驗重復3次，結果取平均值。試驗數據采用Excel 2013 進行整理，采用正交設計助手ⅡV3.1專業版進行設計和分析。

2 結果與分析

2.1 閃式提取葛根黃酮的單因素試驗結果

2.1.1 料液比的確定

由圖1 可以看出，在一定范圍內，隨著乙醇添加比例的增加，得率不斷升高，而超出一定范圍（料液比1∶25（g/mL））后，得率不再提高而趨于穩定。這是因為，在一定范圍內，隨著溶劑的增加，葛根與溶劑的傳質推動力和接觸面積增大，促使葛根黃酮的擴散增多，得率提高；但溶劑到達一定量后，傳質推動力不再增加，抑制了葛根黃酮的擴散和溶出，得率不再提高而趨于穩定，故選擇適宜料液比為1∶25（g/mL）。

圖1 料液比對葛根黃酮得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratios on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.2 提取電壓的確定

由圖2 可知，隨著提取電壓升高，得率先升高后趨于平緩。這是由于升高提取電壓，增大了閃式提取的轉速，使葛根細胞破壁增多，葛根黃酮易于溶出，得率升高。當提取電壓≥150 V后，葛根黃酮的溶出基本完全，再增加電壓，得率也不會明顯提高而趨于穩定，故選擇適宜提取電壓為150 V。

圖2 提取電壓對葛根黃酮得率的影響Fig.2 Effects of extraction voltages on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.3 提取時間的確定

由圖3 可知，隨著提取時間的延長，得率不斷升高，最后逐漸趨于平緩。這是因為物料隨著提取時間的延長受到剪切、碰撞的作用增強，使葛根細胞破碎的程度增強，葛根黃酮的溶出增多，得率增大。當提取時間超過90 s后，葛根細胞內外溶劑濃度達到平衡，再繼續增加提取時間，葛根黃酮溶出不再顯著變化，而趨于平緩，因此選擇適宜提取時間為90 s。

圖3 提取時間對葛根黃酮得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.4 提取次數的確定

由圖4 可知，首次提取后，提取出的葛根黃酮并不徹底，得率僅為3.38%，經第2 次提取，葛根黃酮得率快速增加，達到6.51%，當超過3 次后，葛根黃酮溶出基本完全，繼續增加提取次數，黃酮得率也不再提高，故選擇適宜提取次數為2次。

圖4 提取次數對葛根黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extraction times on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，進行L9(34)正交試驗，結果如表2所示，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 The result of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Table 3 The variance analysis results

由表2和表3分析可知，各因素的影響大小順序為：D＞A＞B＞C，提取次數和料液比對葛根黃酮得率的影響達到顯著水平（P＜0.05），其他因素的影響不顯著。經R值分析，最佳工藝條件為：A3B3C1D2，即提取次數2 次，料液比1∶30（g/mL），提取電壓160 V，提取時間80 s。對上述最佳工藝條件進行3 次驗證試驗，得到葛根黃酮平均得率為6.71%，高于正交試驗中各組合，明顯高于朱德艷[14]采用乙醇回流法提取的葛根黃酮得率（1.62%），且閃式提取法時間短、溫度低，可有效降低提取成本。

2.3 葛根黃酮提取液對四氯化碳致肝損傷小鼠模型的保肝作用影響研究

2.3.1 小鼠血清中AST、ALT活性測定結果

由表4 可知，葛根黃酮提取液試驗組的AST 和ALT 活性與CCl4模型組相比差異極顯著（P＜0.01），表明葛根黃酮提取液明顯降低了CCl4所致的小鼠血清中ALT和AST的活性，具有保肝作用。與正常對照組相比，CCl4模型組AST和ALT活性極顯著升高（P＜0.01），說明CCl4能導致小鼠肝損傷。與CCl4模型組相比，聯苯雙酯組AST 和ALT 活性顯著降低（P＜0.05），但沒有葛根黃酮提取液組下降得多，說明聯苯雙酯能有效治療肝損傷，但效果不如葛根黃酮提取液好。

表4 小鼠血清中AST、ALT活性測定結果Table 4 Determination results of AST and ALT activities in mice sera（n=10） 單位：U/L

2.3.2 小鼠血清中MDA 含量和肝組織中GSH-Px、SOD活性測定結果

由表5可知，CCl4模型組與正常對照組相比，小鼠血清中MDA 含量極顯著升高（P＜0.01），肝組織中GSH-Px 和SOD 活性極顯著降低（P＜0.01）。與CCl4模型組比較，聯苯雙酯組小鼠肝組織中GSH-Px 和SOD活性顯著升高（P＜0.05）；葛根黃酮提取液試驗組小鼠血清中MDA含量顯著降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性極顯著升高（P＜0.01）。表明葛根黃酮提取液能夠顯著降低CCl4所致的小鼠血清中的MDA含量，同時提高小鼠肝組織中GSH-Px和SOD活性。

表5 小鼠血清中MDA含量和肝組織中SOD、GSH-Px活性測定結果Table 5 Determination results of MDA contents in sera and SOD,GSH-Px activities in liver tissues of mice（n=10）

3 結論

本文采用閃式法提取葛根黃酮，在單因素試驗的基礎上，經正交試驗對其工藝進行優化，得到最佳工藝條件為：提取次數2次，料液比1∶30（g/mL），提取電壓160 V，提取時間80 s，在此條件下，葛根黃酮得率達6.71%。該方法省時、節能、高效、環保。通過動物實驗可知，葛根黃酮能夠降低小鼠血清中ALT、AST活性和MDA含量，提高小鼠肝組織中GSH-Px和SOD活性，表明其具有明顯的保肝作用。本試驗可為葛根黃酮的提取及應用研究提供參考。