維生素D受體相關(guān)LncRNAs在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用價(jià)值

張倩 孟穎 支力強(qiáng)

近年來,雖然非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的診斷和治療方式發(fā)展迅速,但其5年平均生存率仍很低,僅為16%,這可能與缺乏早期有效的NSCLC檢測(cè)方法有關(guān)[1]。證據(jù)表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)穩(wěn)定地存在于血液甚至尿液中,并顯示出作為包括NSCLC在內(nèi)的各種腫瘤生物標(biāo)記物的潛力[2-4]。維生素D缺乏癥與包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[5]。先前的研究表明,高維生素D受體(VDR)表達(dá)與肺癌患者更好的預(yù)后相關(guān)[6]。最近,通過生物信息學(xué)分析將SNHG6、SNHG16、LINC00346和LINC00511確定為癌癥中與VDR相關(guān)LncRNAs,并且發(fā)現(xiàn)這些LncRNAs在乳腺癌患者和健康人群中存在差異表達(dá)[7]。然而,VDR相關(guān)LncRNAs在肺癌中的作用尚不清楚。因此,本研究評(píng)估了NSCLC患者血清VDR相關(guān)LncRNAs的表達(dá)情況,以分析它們的診斷價(jià)值及與患者預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、樣品和篩選階段

在癌癥相關(guān)治療前,根據(jù)組織病理學(xué)檢查收集了126例NSCLC患者的所有血清樣本。這些患者于2014年1月至2016年1月在本院接受治療。入選標(biāo)準(zhǔn):1)NSCLC患者,非其他類型肺癌患者;2)病理檢查確診患者;3)愿意參與的患者;4)在本院完成整個(gè)療程,并完成5年隨訪的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):1)合并慢性病等其他疾病的患者;2)治療期間轉(zhuǎn)院的患者;3)患者未能配合研究者;4)患者在隨訪期間死于其他原因。此外,同期從健康志愿者中隨機(jī)招募了90名健康人。從每個(gè)參與者的靜脈血中收集大約3 mL血液樣本。使用兩步離心法將所有血清分離出來,以完全去除血細(xì)胞(在4℃下2000×g持續(xù)5分鐘;在4℃下12000×g持續(xù)5分鐘)。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(批準(zhǔn)文號(hào):2013048)。

篩選階段分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。訓(xùn)練集納入20對(duì)樣本,包括20例NSCLC患者和20例健康對(duì)照;驗(yàn)證集包含106例NSCLC患者和70例健康對(duì)照。根據(jù)年齡、性別、NSCLC家族史、飲酒狀況和吸煙狀況,將對(duì)照組與NSCLC患者進(jìn)行匹配。

二、實(shí)時(shí)定量PCR

使用TRIzol試劑從血漿樣品中獲得總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用于分析的20 μL RT反應(yīng)系統(tǒng)包括8 μL總RNA,4 μL的5×PrimeScript Buffer,0.5 μL RT Primer Mix,0.5 μL PrimeScript RT酶混合物I和7 μL無RNase水。使用以下方案進(jìn)行反應(yīng):37℃ 15 min,然后85℃ 5 s和4℃ 10 s。隨后,使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)在20 μL反應(yīng)混合物中一次通過定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)cDNA樣品,其中包括10 μL SYBR?Premix Ex Taq II,2 μL RT反應(yīng)產(chǎn)物,0.8 μL正向引物,0.8 μL反向引物和6.4 μL無RNase水。設(shè)定條件如下:在95℃下進(jìn)行30s一次變性,在95℃ 5s和60℃ 30s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。考慮到β-actin mRNA在血清中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定,以β-actin為內(nèi)參基因。相對(duì)表達(dá)水平是使用Δ循環(huán)閾值(CT)值方法計(jì)算的,ΔCT=CT(目標(biāo)基因)-CT(內(nèi)參基因)。CT值>40的樣品視為陰性結(jié)果。

三、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分析

通過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分析構(gòu)建血清LncRNAs診斷模型,以區(qū)分NSCLC患者和對(duì)照組。將對(duì)照中每個(gè)LncRNA值的上限95%參考間隔設(shè)置為閾值,以將每個(gè)樣本中相應(yīng)LncRNA的表達(dá)水平編碼為訓(xùn)練集中的0和1。根據(jù)每個(gè)LncRNA表達(dá)水平的線性組合,定義了預(yù)測(cè)NSCLC組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分函數(shù)(RSF)。來自4個(gè)LncRNA樣本信息的RSF計(jì)算如下:rsfi=∑3j-1Wj.sij。在上式中,sij是樣本i上LncRNA j的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,而Wj是LncRNA j風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的權(quán)重。4個(gè)LncRNA的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是通過每個(gè)LncRNA的單變量Logistic回歸分析得出的回歸系數(shù)的權(quán)重來計(jì)算的。用各風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的回歸系數(shù)作為權(quán)重來表示各LncRNA對(duì)RSF的貢獻(xiàn)。應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分函數(shù)法建立診斷模型,ROC法確定合適的臨界值,AUC法評(píng)價(jià)模型的診斷性能,并在下一個(gè)驗(yàn)證樣本集中驗(yàn)證過程和截止值。

四、隨訪

所有NSCLC患者出院后均通過電話或門診隨訪5年。每1或2個(gè)月進(jìn)行一次隨訪,直至隨訪結(jié)束或患者死亡。在隨訪過程中失訪或因NSCLC以外的其他原因死亡的患者被排除在本研究之外。

五、數(shù)據(jù)分析

采用卡方檢驗(yàn)、學(xué)生t檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)各組的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征進(jìn)行比較。采用Fisher精確檢驗(yàn)分析血清非編碼RNA診斷模型危險(xiǎn)度評(píng)分與臨床因素構(gòu)成比的差異。使用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并通過log rankt檢驗(yàn)比較。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征

NSCLC組和對(duì)照組在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集上的年齡和性別分布相似(P>0.05)(表1)。

表1 研究對(duì)象的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征

二、NSCLC患者和健康對(duì)照者的VDR相關(guān)LncRNAs表達(dá)

訓(xùn)練集中,SNHG6、SNHG16、LINC00346和LINC00511在NSCLC和對(duì)照樣品之間表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)(P<0.05)(表2)。此外,驗(yàn)證集中這4種LncRNA的變化與訓(xùn)練集中的變化一致。

表2 兩組血清中VDR相關(guān)LncRNAs的差異表達(dá)

三、ROC曲線分析LncRNA的診斷性能

當(dāng)截?cái)嘀禐?0.429時(shí),訓(xùn)練集中四個(gè)LncRNA聯(lián)合的AUC為0.875(95%CI:0.755～0.995),最佳敏感度和特異度分別為95.0%和81.0%(表3)。當(dāng)截?cái)嘀禐?0.429時(shí),驗(yàn)證集中四個(gè)LncRNA聯(lián)合的診斷性能更高,AUC為0.824(95%CI:0.754～0.894),靈敏度和特異度分別為93.4%和74.3%(表3,圖1A和B)。

圖1 四種VDR相關(guān)LncRNA用于區(qū)分NSCLC患者和對(duì)照的ROC分析(A)訓(xùn)練集;(B)驗(yàn)證集

表3 NSCLC患者和對(duì)照之間每種LncRNA的診斷性能

四、血清VDR相關(guān)LncRNA與人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床因素和不良預(yù)后的關(guān)聯(lián)

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將NSCLC病例分為高風(fēng)險(xiǎn)組(≥10.429)和低風(fēng)險(xiǎn)組(<10.429),不同風(fēng)險(xiǎn)組在腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移期之間存在明顯的差異(P<0.05)(表4)。與低風(fēng)險(xiǎn)組患者相比,高風(fēng)險(xiǎn)組患者表現(xiàn)出明顯較低的總體存活率(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同風(fēng)險(xiǎn)組患者的存活曲線

表4 四種VDR相關(guān)LncRNA的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與NSCLC患者的臨床因素相關(guān)性分析

討 論

維生素D具有多種生物活性,如抗增殖和促進(jìn)分化,增強(qiáng)了其作為抗癌劑的作用。研究發(fā)現(xiàn),維生素D的抗增殖作用是通過與VDR的結(jié)合介導(dǎo)[8]。VDR通過與許多其他中介直接或間接交互來擴(kuò)展其信號(hào)傳輸。其中,LncRNA作為VDR的重要中介之一,二者通過相互作用進(jìn)行交叉調(diào)控[9]。先前的研究鑒定了4種VDR相關(guān)LncRNA(SNHG16、SNHG6、LINC00346、LINC00511),并發(fā)現(xiàn)這些LncRNA參與了腎癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌的發(fā)病過程,并與不良預(yù)后相關(guān)[10-11]。本研究中,我們鑒定了NSCLC患者和健康對(duì)照者血清中的4種差異表達(dá)的VDR相關(guān)LncRNA,它們?cè)讵?dú)立樣本中得到了驗(yàn)證。更重要的是,4種LncRNA在區(qū)分NSCLC患者和健康者方面顯示出高診斷性能。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了循環(huán)中的VDR相關(guān)LncRNA可以作為NSCLC診斷的非侵入性生物標(biāo)記物。

血清中的循環(huán)RNA是一個(gè)新興的快速發(fā)展的分子診斷領(lǐng)域,這使得循環(huán)RNA在高通量臨床篩選和監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用成為可能。LncRNAs常形成高度穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),有利于定量檢測(cè)體液中的游離RNA。近年來,有報(bào)道表明,血清LncRNAs可作為腫瘤檢測(cè)的特異性生物標(biāo)記物[12]。更重要的是,一些循環(huán)中的LncRNA已被證明是癌癥中有價(jià)值的生物標(biāo)記物,例如前列腺癌中的尿MALAT-1,胃癌中的血漿H19[13]。在本研究納入的NSCLC患者中,4種VDR相關(guān)LncRNA的表達(dá)顯著升高。其中,SNHG16和LINC00511的表達(dá)水平與之前的研究相當(dāng)[9]。SNHG16是SNHG的重要成員,最近研究表明SNHG16在胃癌或乳腺癌患者血漿中均有表達(dá),并且其水平升高與預(yù)后不良和總生存期縮短有關(guān)[14]。LINC00265作為一種內(nèi)源性海綿,對(duì)抗多個(gè)miRNAs,在卵巢癌、結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)[15]。此外,血清SNHG6、LINC00346表達(dá)上調(diào)被發(fā)現(xiàn)與大腸癌、胃癌預(yù)后不良有關(guān)[16]。為了檢驗(yàn)4種VDR相關(guān)LncRNA在NSCLC早期診斷中的預(yù)測(cè)能力,研究還進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分析,以檢驗(yàn)4種LncRNA的預(yù)測(cè)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4個(gè)因素的聯(lián)合具有很高的敏感度和特異度,AUC為0.824,表明4種VDR相關(guān)LncRNA可能是預(yù)測(cè)NSCLC的標(biāo)志。預(yù)后分析顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組患者表現(xiàn)出明顯較低的總體存活率。因此,4種VDR相關(guān)LncRNAs聯(lián)合應(yīng)用可能是NSCLC的一個(gè)潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

總之,本研究綜合評(píng)估了血清中VDR相關(guān)LncRNA對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值,發(fā)現(xiàn)4種LncRNAs聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NSCLC的診斷具有較高的敏感度和特異度,鑒別診斷準(zhǔn)確率較高,并且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。