miR-17-5p通過靶向HDAC4抑制PMEC細胞凋亡及促進EMT

霍寅萍 褚慶霞

人肺黏液表皮樣癌(pulmonary mucoepidermoid carcinoma,PMEC)是一種起源于氣管和支氣管黏膜下庫爾奇斯基(Kurchisky)細胞的罕見肺唾液腺癌,主要表達MAML2(mastermind like transcriptional coactivator 2) 基因重排[1]。據細胞形態分為低級和高級,其中高級別侵襲強、易轉移[2-3]。PMEC的治療與非小細胞肺癌相同,但PMEC的生存率卻較低[1]。因此,探索PMEC的新靶點具有重要意義。MicroRNA (miRNA)是一種單鏈非編碼小RNA,能調節基因表達[4]。研究發現血清中miR-17-5p高表達與肺癌患者存活率差相關[5]。本研究中miR-17-5p在PMEC中高表達,促進細胞增殖、遷移和侵襲,抑制細胞凋亡。經生物信息學預測HDAC4(histone deacetylase 4)是miR-17-5p可能的靶標。并發現miR-17-5p 靶向 HDAC4調控 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 和細胞凋亡。綜上,在PMEC中miR-17-5p可作為一種癌基因,為PMEC發病的潛在分子機制和可能的靶向治療提供了新的見解。

資料與方法

一、組織標本

收集2016 年1月至 2021 年12月,從江蘇省人民醫院浦口分院接受手術治療的PMEC患者中獲取15對癌組織及其匹配的鄰近非癌組織。均未接受術前治療,通過組織病理學確診。收集新鮮的組織標本立即儲存在液氮中。該研究是根據世界醫學協會的赫爾辛基宣言(2008年)進行的。本研究經江蘇省人民醫院浦口分院醫學倫理委員會批準(2016-SR-003),并獲得每位患者的書面知情同意。

二、細胞培養和轉染

NCI-H292細胞系(人肺黏液表皮樣癌細胞系)、BEAS-2B細胞系(人正常支氣管上皮細胞系)和HEK-293T(人胚腎細胞系)具有STR細胞鑒定,均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫,實驗前通過支原體檢測。用含有 10% FBS(Gibco-BRL,美國)和 1% 青霉素/鏈霉素(Gibco-BRL,美國)的 RPMI-1640(Gibco-BRL,美國)培養,置于 37 ℃ 的含5 % 二氧化碳加濕細胞培養箱中。使用 Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,CA)將 miR-17-5p 抑制劑(inhibitor)、模擬物(mimic)、miRNA 對照組(ctrl)、HDAC4小干擾(siHDAC4)或其對照組(siNC)(吉瑪,上海,中國)轉染到 NCI-H292 細胞中,48 小時后收集細胞 RNA, 72 小時后收集細胞蛋白。

三、RNA 提取和定量

使用 Trizol 試劑(Life Technologies,美國)從組織和細胞中提取總 RNA。 MMLV 逆轉錄酶(Takara,大連,中國)進行逆轉錄,并使用 TB Green?Premix Ex TaqTM(Takara,大連,中國)通過qPCR 定量 miR-17-5p 和 HDAC4 mRNA 的相對表達水平,以U6為內參,通過2-ΔΔCt計算進行歸一化。使用引物序列如下:hsa-miR-17-5p:RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT,正向:5′-GCGCAAAGTGCTTTACAGTGC-3′,反向:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; HDAC4:正向:5′-GCCTGGGAGCACTGCCCCTCCACGCACA-3′,反向:5′-CTTGTTCATCTGCAGTTGCTGCTGC-3′; U6:正向:5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向:5′-AATATGGAACGCTTCACGA-3′。

四、細胞增殖測定

96孔板中每孔接種3000個細胞,細胞增殖試劑盒-8(CCK-8,中國大連)連續3天評估細胞活力。用酶標儀(BioTek,Epoch,USA)在 450 nm 處讀取吸光度值。進行三次獨立的實驗。

五、Transwell試驗

細胞轉染24 h后將細胞接種于無血清培養的上室,下室700 μL含10%FBS的培養基。侵襲實驗中需要先將稀釋的基質膠(1 ∶6 無血清培養基)(BD Biosciences CA,美國)鋪在上室。遷移實驗中細胞接種于上室后培養 24 h,而侵襲實驗細胞中培養48 h。甲醇固定,結晶紫染色,倒置顯微鏡(Carl Zeiss,德國)隨機選取3個不重疊的區域進行細胞計數。獨立實驗進行3次。

六、細胞凋亡檢測

細胞轉染 48 h后收集細胞,細胞重懸于磷酸鹽緩沖液 (PBS) 中并與 Annexin V-FITC 室溫避光孵育 15 min,在流式細胞儀檢測前5分鐘加入碘化丙啶 (PI),在半小時內上流式檢測儀(Mloflox xdp,Beckman, San Jose, CA,美國)進行檢測,實驗獨立完成3次。

七、蛋白印跡分析

細胞轉染72 h后,用RIPA(碧云天,中國)收集細胞提取蛋白,用BCA檢測試劑盒(碧云天,中國)測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳后,等量蛋白濕轉到聚偏二氟乙烯(PVDF,Millipore Corporation,Billerica,MA,美國)膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1小時,加入適量一抗4℃孵育過夜(抗HDAC4,1:2000;抗N-cadherin,1 ∶1 000;抗Vimentin,1 ∶1 000;抗 Bcl-2,1 ∶1 000;抗 Bax,1 ∶1 000;抗 Cleaved-Caspase 3,1 ∶1 000;抗 GAPDH,1 ∶1 000;以上均來自 CST,Beverly,MA,美國)。 用含有 Tween 20的 Tris 緩沖鹽溶液(TBST)清洗膜半小時,在室溫下用兔二抗(1:2000,CST,Beverly,MA,美國)孵育 1 小時,再洗膜半小時。后用ImmobilobTMWestern 化學發光 HRP 底物(Millipore,Billerica,MA,美國)在全自動化學發光成像分析系統曝光成像。

八、熒光素酶報告基因檢測

miR-17-5p mimic或其陰性對照和 HDAC4-MUT 或 HDAC4-WT 報告質粒(吉瑪,上海,中國)使用 Lipofectamine 3000 共轉染到 HEK-293T 細胞中,48 h后 PBS 洗滌細胞加入被動裂解液,室溫輕搖15 min充分裂解細胞。使用熒光素酶報告基因檢測系統(Promega,美國)評估熒光素酶活性,進行3次獨立實驗。

九、統計學處理

結 果

一、miR-17-5p在人 PMEC 組織和細胞系中高表達

15 組 PMEC 組織及其鄰近非癌組織中提取 RNA,qPCR檢測miR-17-5p,發現腫瘤組織中miR-17-5p的表達較鄰近非癌組織顯著上調(見圖1A)。 與人支氣管上皮細胞相比,PMEC細胞(NCI-H292)中miR-17-5p 的表達也明顯升高(見圖 1B)。結果表明miR-17-5p可能與人PMEC的發生發展有關。

圖1 miR-17-5p在PMEC組織和細胞中的表達A:miR-17-5p在PMEC及其鄰近非癌組織中的表達差異(n=15); B:BEAS-2B及NCI-H292細胞中miR-17-5p的表達差異(***P<0.001)

二、miR-17-5p促進NCI-H292細胞增殖

為了確定 miR-17-5p在PMEC中的作用,我們合成了miR-17-5p inhibitor和mimic。將miR-17-5p inhibitor或mimic轉染NCI-H292細胞后48小時收集細胞RNA,通過qPCR分析轉染效率(見圖2A)。CCK-8實驗表明,miR-17-5p inhibitor組的細胞增殖降低,但 miR-17-5p mimic組的細胞增殖明顯增加(見圖2B)。對72h細胞增殖活性結果的進一步分析表明,這種增殖差異具有顯著統計學意義(見圖2C)。結果表明 miR-17-5p 促進 NCI-H292 細胞增殖。

圖2 miR-17-5p對NCI-H292細胞的增殖影響A:miR-17-5p在NCI-H292細胞中的轉染效率;B:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后的細胞增殖對比;C:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞72小時后的細胞增殖比較(**P<0.01,***P<0.001)

三、miR-17-5p抑制NCI-H292細胞凋亡

使用流式細胞儀檢測 NCI-H292 細胞的凋亡,發現 miR-17-5p inhibitor組的細胞凋亡顯著增加,而 miR-17-5p mimic組的細胞凋亡明顯減少(見圖3A,3B)。 提示miR-17-5p在NCI-H292中具有抑制細胞凋亡的作用。

圖3 miR-17-5p對NCI-H292細胞凋亡的影響A:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后的細胞凋亡圖;B:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后的細胞凋亡對比(*P<0.05, **P<0.01)

四、miR-17-5p 促進 NCI-H292 細胞的遷移和侵襲

進一步研究miR-17-5p 對PMEC 細胞遷移和侵襲的影響。Transwell 遷移和侵襲實驗表明,miR-17-5p mimic組中遷移和侵襲的細胞數量顯著增加,而inhibitor組的結果則相反(見圖4A、4B、4C)。結果證實miR-17-5p能促進NCI-H292細胞的遷移和侵襲。

圖4 miR-17-5p對NCI-H292細胞遷移和侵襲的影響A:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后的遷移和侵襲圖(放大倍數×100,標尺=20μm);B:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后的遷移對比;C:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后的侵襲比較 (*P<0.05, **P<0.01)

五、HDAC4在PMEC中上調,miR-17-5p正向調節HDAC4的表達

為確定miR-17-5p的主要靶基因,我們使用三個數據庫(TargetScan、PicTar和miRDB)進行預測并發現組蛋白去乙酰化酶HDAC4可能是miR-17-5p 的靶標,且 miR-17-5p 可以與 HDAC4 的 3′UTR 結合(見圖5A)。為進一步驗證我們生成了編碼 HDAC4 3′UTR 的報告基因構建體,該構建體包含預測的 miR-17-5p 結合序列(HDAC4-WT)或突變序列(HDAC4-MUT)(見圖5A),并與合成的 miR-17-5p mimic或對照共轉染到 HEK-293T 細胞中,48 小時后使用熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性,結果顯示miR-17-5p mimic能增加HDAC4-WT組熒光素酶活性(見圖5B)。同時發現,抑制 miR-17-5p 會降低 HDAC4 mRNA 的表達,而過表達 miR-17-5p 則增加 HDAC4 mRNA 的表達(見圖5C)。在 PMEC 組織和細胞系中也檢測到 HDAC4 mRNA均顯著上調(見圖5D、5E),從而證明 miR-17-5p通過錨定 HDAC4 的 3′UTR 直接上調 HDAC4。

圖5 miR-17-5p結合HDAC4 3′UTR對HDAC4表達影響及HDAC4在PMEC中的表達A:miR-17-5p與HDAC4 3′UTR的結合序列及突變序列;B:miR-17-5p與HDAC4 3′UTR結合的熒光素酶活性檢測;C:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后HDAC4 mRNA表達情況;D:PMEC組織及其鄰近非癌組織中HDAC4 mRNA表達對比;E:BEAS-2B及NCI-H292細胞中HDAC4 mRNA表達對比(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

六、miR-17-5p靶向HDAC4促進EMT,并抑制細胞凋亡

眾所周知,EMT在多種生理和病理過程中對腫瘤轉移起著重要的調節作用。接下來,使用蛋白印跡(WB)檢測 EMT 相關的信號分子。有趣的是,我們發現用 miR-17-5p inhibitor處理NCI-H292 細胞中,隨著 HDAC4 的減少,N-鈣黏蛋白和波形蛋白被下調,而轉染 miR-17-5p mimic的 NCI-H292 細胞中結果相反(見圖6A)。我們還檢測了與細胞凋亡相關的信號分子,隨著抑制miR-17-5p后HDAC4的減少,抗凋亡因子Bcl-2下調,促凋亡因子Bax和Cleaved Caspase-3 明顯上調,而miR-17-5p過表達后結果相反。同時我們發現使用siHDAC4可以逆轉miR-17-5p mimic的上述結果(見圖6B)。這些結果表明miR-17-5p通過靶向HDAC4促進EMT并抑制細胞凋亡。

圖6 miR-17-5p靶向HDAC4影響EMT及凋亡相關蛋白的表達A:miR-17-5p轉染NCI-H292細胞后蛋白表達圖;B:miR-17-5p及HDAC4共轉染NCI-H292細胞后蛋白表達圖

討 論

miR-17-5p 已被證實在腫瘤進展中起關鍵作用,如乳腺癌、骨肉瘤、胰腺癌和胃癌[6-8]。miR-17-5p 在 PMEC 中的作用尚不明確,我們的研究發現 miR-17-5p 促進 PMEC細胞的增殖、遷移和侵襲,并抑制細胞凋亡,表明 miR-17-5p 在 PMEC 的發展中起著重要作用。通過生物信息學分析發現HDAC4 是miR-17-5p 的潛在靶標,熒光素酶報告基因分析和蛋白質印跡分析證實了miR-17-5p 能與 HDAC4 3′UTR 結合以調控HDAC4的表達。HDAC4是Ⅱ類組蛋白去乙酰酶 (HDAC) 的關鍵成員之一。據以往的研究,HDAC4被多種miRNAs靶向,參與了多種惡性腫瘤的增殖、遷移侵襲和凋亡。

據統計超過 90% 的癌癥相關死亡是由轉移性疾病而不是相應的原發腫瘤引起的,這表明轉移仍然是癌癥患者最危及生命的風險因素[9-10]。與間充質細胞狀態相關的運動性/侵襲性的增加將 EMT與轉移聯系起來。我們檢測了與 EMT 相關的信號分子以進行進一步驗證。將miR-17-5p 模擬物處理 PMEC 細胞后,HDAC4 表達增加,同時EMT 相關信號分子 N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達也隨之增加,并促進了凋亡抑制因子Bax的表達,抑制了促凋亡因子Bcl-2和Cleaved-Caspase 3的表達,而干擾HDAC4后可逆轉上述作用。

HDAC4是如何影響EMT和凋亡相關蛋白,需要進一步闡明,HDAC4 是一類組蛋白去乙酰酶,參與表觀遺傳調控。表觀遺傳修飾主要通過組蛋白乙酰化調節腫瘤相關miRNA的表達,同時miRNA 還可以調節表觀遺傳學,兩者的相互調節可調控腫瘤基因表達并在體內誘導惡性腫瘤[11]。我們推測HDAC4是通過去乙酰化EMT和凋亡相關的信號分子中的組蛋白,進而參與了它們的表觀遺傳調控。總之,我們首次報道了 miR-17-5p 在人PMEC 中上調并具有致癌基因效應,miR-17-5p 通過直接作用于其靶標HDAC4基因,促進人PMEC 細胞增殖、EMT并抑制細胞凋亡。我們的研究為人PMEC的發病機制提供了新的見解,并強調了miR-17-5p/HDAC4 通路介導的 EMT 和細胞凋亡在 PMEC 進展中的作用,miR-17-5p有望成為治療人PMEC新的突破點。