宏基因組二代測(cè)序在免疫抑制患者肺部浸潤(rùn)病因診斷中的應(yīng)用

吳琴 王葆青 余榮環(huán) 黃潔

感染是免疫抑制患者最常見(jiàn)的疾病,病死率極高[1-2],其中肺是最常見(jiàn)的靶器官,肺部影像常表現(xiàn)浸潤(rùn)陰影。免疫抑制患者出現(xiàn)肺部陰影的原因還包括化療藥物的使用[3](如利妥昔單抗[4])、腫瘤肺部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、放射性肺炎、肺水腫等[5]。因此亟需一種快速精準(zhǔn)的病原學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行鑒別診斷。宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS)不依賴培養(yǎng),具有廣而全的篩查特質(zhì)[6]。對(duì)于難培養(yǎng)的微生物具有明顯優(yōu)勢(shì)[7],同時(shí)也具有較好的陰性預(yù)測(cè)價(jià)值[8]。本研究通過(guò)對(duì)上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科出現(xiàn)肺部浸潤(rùn)的免疫抑制患者的一般資料、臨床特點(diǎn)、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及mNGS結(jié)果予以前瞻性分析研究,探究mNGS在出現(xiàn)肺部浸潤(rùn)的免疫抑制患者病因診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

前瞻性納入2019年11月至2022年11月間我科收治的出現(xiàn)肺部浸潤(rùn)的免疫抑制患者60例。

二、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1 納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥18歲。②所有患者均經(jīng)免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)明確存在不同程度的免疫抑制。③入院時(shí)胸片和(或)胸部 CT提示肺部新出現(xiàn)浸潤(rùn)陰影而病因診斷未明者。④入組前全身等部位無(wú)原發(fā)感染性疾病。

2 排除標(biāo)準(zhǔn):①妊娠或哺乳期婦女。②合并精神異常者。③多臟器功能衰竭者。④mNGS等樣本未通過(guò)質(zhì)量控制。

三、本研究獲得了上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[倫理編號(hào):(2020)科審第(126)號(hào)]。所有患者或家屬均知情同意,并簽署了知情同意書(shū)。

四、研究方法

1 樣本的采集及處理 樣本采集:(1)肺泡灌洗液:根據(jù)患者肺部影像學(xué),對(duì)于病變局限者,選擇病變部位引流進(jìn)行支氣管肺泡灌洗;對(duì)于彌漫性病變者,選擇右肺中葉或左上葉舌段進(jìn)行灌洗。(2)其它(血液、深部痰液、肺組織、胸水):部分患者經(jīng)評(píng)估無(wú)法耐受或拒絕支氣管鏡時(shí)采集。

樣本處理:所有入組患者入院后,采集合適部位樣本按照醫(yī)院流程進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),包括:血常規(guī)、C-反應(yīng)蛋白(C-Reaction Protein, CRP)、微生物培養(yǎng)、涂片鏡檢(革蘭氏染色、抗酸染色、六胺銀染色)、γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assay, IGRA)、血隱球菌抗原檢測(cè)、(1-3)-β-D葡聚糖檢測(cè)(Glucan, G)、半乳甘露聚糖檢測(cè)(Galactomannan, GM)、腫瘤細(xì)胞檢查(組織病理、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化)等。同時(shí)該樣本規(guī)范按照mNGS 送檢標(biāo)本流程進(jìn)行樣本核酸提取、文庫(kù)制備、文庫(kù)測(cè)序、序列與微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的檢測(cè)。

2 mNGS陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn) 參考mNGS在感染性疾病的專家共識(shí)[9]:(1)細(xì)菌(分枝桿菌、諾卡菌除外):檢出細(xì)菌(種水平)的序列數(shù)是其余所有細(xì)菌的10倍以上。(2)真菌:檢出真菌(種水平)的序列數(shù)是其余所有真菌的5倍以上。(3)結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB):至少檢出1條(種或?qū)偎?結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群序列[10]。(4)非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM):檢出序列數(shù)(種或?qū)偎?在原始細(xì)菌列表排名前10位。(5)病毒:檢出序列數(shù)應(yīng)至少覆蓋全基因組的 3 個(gè)非重疊區(qū)域。

3 病原體鑒定及臨床診斷 由有經(jīng)驗(yàn)的臨床專家結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、mNGS結(jié)果及治療療效進(jìn)行綜合診斷。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將納入研究的60例患者的檢測(cè)結(jié)果錄入 Excel 表格,并用SPSS 24.0 軟件分析。計(jì)數(shù)資料:統(tǒng)計(jì)例數(shù)和百分比;比較采用卡方檢驗(yàn)或 Fisher 確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料及預(yù)后

研究共納入60例患者,平均年齡65.9歲,中位年齡67.0歲。疾病類型主要包括:血液系統(tǒng)疾病(彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤6例、霍奇金淋巴瘤2例、慢性骨髓增殖性腫瘤1例、骨髓增生異常綜合征1例)、實(shí)體腫瘤(肺癌9例、食管癌9例、乳腺癌6例、結(jié)腸癌6例、鼻咽癌2例、膀胱癌、膽管癌、喉癌和胃癌各1例)、自身免疫病(干燥綜合征3例、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎2例、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)相關(guān)性血管炎、混合性結(jié)締組織病、原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、大皰性類天皰瘡、自身免疫相關(guān)性腦病各1例)、糖尿病和獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)患者?；颊呋咎卣骷邦A(yù)后(見(jiàn)表1)。

表1 患者基本信息及預(yù)后

二、mNGS檢驗(yàn)效能及一致性分析

60例患者mNGS和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的陽(yáng)性例數(shù)和陽(yáng)性率分別為:mNGS:53例陽(yáng)性,陽(yáng)性率為88.3%;常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法:(1)涂片:16例陽(yáng)性,陽(yáng)性率為26.7%。(2)培養(yǎng): 18例陽(yáng)性,陽(yáng)性率為30.0%。(3) G/GM試驗(yàn):3例陽(yáng)性,陽(yáng)性率為5.0%。(4)γ干擾素釋放試驗(yàn) /血隱球菌抗原檢測(cè):5例陽(yáng)性,陽(yáng)性率為8.3%。(5)病理/流式:1例陽(yáng)性,陽(yáng)性率為1.7%。5種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的總體陽(yáng)性率為55.0%,mNGS的陽(yáng)性率與其相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=120.00,P<0.001)(見(jiàn)圖1)。

圖1 mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)比注:**表示兩組間比較P<0.01

一致性結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2,表2):55.0%(33/60)患者樣本的mNGS檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果一致。(1)75.8%(25/33)患者樣本的兩種檢測(cè)結(jié)果完全一致,6例患者兩類檢測(cè)結(jié)果均為陰性,最終臨床分別診斷為2例脂質(zhì)性肺炎,1例化學(xué)性肺炎,1例放射性肺炎,1例淋巴瘤肺內(nèi)浸潤(rùn)和1例結(jié)締組織病肺累及。19例患者兩類檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,14例為感染患者,責(zé)任病原分別為結(jié)核分枝桿菌5例、新生隱球菌2例、白色念珠菌2例、金黃色葡萄球菌1例、鮑曼不動(dòng)桿菌1例和銅綠假單胞菌1例、Mycolicibacterium cosmeticum(非結(jié)核分枝桿菌之一)1例、馬爾尼菲藍(lán)狀菌1例。其余5例患者陽(yáng)性結(jié)果均為定植微生物,均排除感染。(2)24.2%(8/33)患者樣本的檢測(cè)結(jié)果部分一致,部分一致的原因是由于mNGS額外檢出了常規(guī)檢測(cè)未檢出的病原微生物,其中3例額外檢出病毒,2例額外檢出細(xì)菌,2例額外檢出細(xì)菌和真菌,1例額外檢出真菌。

圖2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法與mNGS結(jié)果的一致性分析注:中間橙色表示檢測(cè)結(jié)果一致;中間藍(lán)色表示檢測(cè)結(jié)果不一致。左側(cè)33例(55%)為mNGS與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果一致:75.8%(25/33)為兩種檢測(cè)結(jié)果完全一致,24.2%(8/33)由于mNGS的額外檢出與臨床檢測(cè)結(jié)果部分一致;右側(cè)27例(45%)為兩種檢測(cè)結(jié)果不一致:74.1%(20/27)mNGS陽(yáng)性,常規(guī)檢測(cè)陰性,22.2%(6/27)兩種檢測(cè)陽(yáng)性,但陽(yáng)性結(jié)果不一致,3.7%(1/27)mNGS陰性,常規(guī)檢測(cè)陽(yáng)性

表2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法與mNGS結(jié)果的一致性分析統(tǒng)計(jì)

45%(27/60)患者樣本的mNGS檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不一致(見(jiàn)圖2,表2):(1)74.1%(20/27)樣本的mNGS檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性,而臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為陰性,最終17例根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果與臨床表現(xiàn)確診為感染。(2)22.2%(6/27)樣本的mNGS檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果完全不一致,6例患者中有4例通過(guò)mNGS檢測(cè)確診為感染(病原微生物分別為膿腫分枝桿菌、煙曲霉、耶氏肺孢子菌和鏈球菌)。(3)3.7%(1/27)樣本的mNGS檢測(cè)結(jié)果為陰性,而臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)GM試驗(yàn)陽(yáng)性,患者最終確診為肺曲霉感染。

三、免疫抑制患者樣本病原譜分析

60例患者樣本共檢出126株病原體(見(jiàn)圖3),包括細(xì)菌62株,檢出前三位分別為鮑曼不動(dòng)桿菌9株、副流感嗜血桿菌8株,金黃色葡萄球菌7株;真菌41株:耶氏肺孢子菌5株、念珠菌24株、曲霉9株、新生隱球菌2株和馬爾尼菲藍(lán)狀菌1株;分枝桿菌7株:結(jié)核分枝桿菌5株、非結(jié)核分枝桿菌2株;病毒16株。

圖3 mNGS檢出病原譜

四、病因分析

患者出現(xiàn)肺部浸潤(rùn)的最主要原因?yàn)楦腥?共42名患者確診,占70.0%,其中混合感染11例,占感染患者總數(shù)的26.2%(11/42)。其它原因還包括化學(xué)性肺炎(5例,8.3%)、脂質(zhì)性肺炎(2例,3.4%)、放射性肺炎(2例,3.4%)、淋巴瘤肺內(nèi)浸潤(rùn)(2例,3.4%)、結(jié)締組織病肺累及(2例,3.4%)、轉(zhuǎn)移性肺癌(2例,3.4%)、機(jī)化性肺炎(2例,3.4%)、肺腺癌(1例,1.7%)。確診為感染患者的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞值與非感染患者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但CRP的t值為2.093,P=0.044(<0.05),兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

確診為感染的患者中有25例為細(xì)菌感染(包括5例結(jié)核分枝桿菌和2例非結(jié)核分枝桿菌),其中7例分枝桿菌mNGS全部檢出,5例抗酸染色陽(yáng)性和(或)γ-干擾素釋放試驗(yàn)陽(yáng)性;17例為真菌感染(包括5例合并細(xì)菌感染),其中死亡率為29.4%(5/17),占本研究死亡人數(shù)的83.3%(5/6)。在尋找肺部出現(xiàn)浸潤(rùn)的患者病因時(shí)mNGS的靈敏度為97.7%,特異度為52.9%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84.0%,陰性預(yù)測(cè)值為90.0%。

討 論

目前臨床對(duì)于免疫抑制患者并發(fā)肺部浸潤(rùn)陰影的早期診斷率低,多采用經(jīng)驗(yàn)性多種藥物抗感染治療,極易誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥、延長(zhǎng)住院時(shí)間、增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、加重臟器功能損害等。因此,早期選擇合適的病原學(xué)檢測(cè)方法,是對(duì)患者快速診斷、精準(zhǔn)治療和決定預(yù)后的關(guān)鍵。mNGS在感染檢測(cè)方面具有極大的優(yōu)勢(shì),它直接從樣本中提取全部微生物的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序,提供詳盡的微生物圖譜,能夠有效的檢測(cè)肺部混合感染并縮短檢測(cè)時(shí)間[11],在血流感染[12-13]方面也有著比血培養(yǎng)更高的陽(yáng)性率。對(duì)微生物診斷產(chǎn)生了革命性的影響[14]。

本研究通過(guò)將多種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法與mNGS進(jìn)行比較,結(jié)果顯示mNGS具備多方面的優(yōu)勢(shì)。第一,mNGS對(duì)于感染的鑒別診斷明顯優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè),尤其是在耶氏肺孢子菌和曲霉的檢測(cè)方面,傳統(tǒng)方法只檢出2例曲霉菌感染;第二,mNGS的陰性結(jié)果對(duì)于排除感染性疾病具有很大的價(jià)值,陰性預(yù)測(cè)值為90.0%;第三,在患者病因分析中,mNGS具有很高的靈敏度和較高的特異度,分別為97.7%和52.9%。

我們也發(fā)現(xiàn)免疫抑制患者肺部浸潤(rùn)的最主要病因是感染(70.0%),其中40.5%(17/42)的患者為肺部真菌感染,如耶氏肺孢子菌肺炎(pneumocystis pneumonia, PCP)和侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)等。有研究報(bào)道急性淋巴細(xì)胞白血病或淋巴增殖性疾病患者PCP的發(fā)病率約40%[15]。而診斷為IPA的患者中,死亡率仍高達(dá)60%[16]。在本研究中真菌感染的死亡率為29.4%(5/17),占本研究全部死亡患者的83.3%(5/6),是造成患者死亡的主要原因。

由于本研究樣本量較少,也未進(jìn)行RNA病毒的檢測(cè),后續(xù)有待大樣本同時(shí)進(jìn)行DNA和RNA測(cè)序的研究驗(yàn)證mNGS在免疫缺陷宿主肺部浸潤(rùn)的診斷價(jià)值。

綜合上述,免疫抑制患者肺部浸潤(rùn)的病因診斷是對(duì)臨床工作者的重大考驗(yàn),選擇合適的病原學(xué)診斷方法尤為關(guān)鍵。對(duì)比傳統(tǒng)方法,mNGS作為一種有效的檢測(cè)手段,可提高肺部浸潤(rùn)的免疫抑制患者的病原微生物檢出率,有效的區(qū)分感染與非感染,精準(zhǔn)的診斷病因,從而指導(dǎo)抗感染藥物的應(yīng)用、提升治療效果和改善預(yù)后。因此,mNGS在臨床精準(zhǔn)診斷肺部出現(xiàn)浸潤(rùn)的免疫抑制患者病因分析中有很高的應(yīng)用價(jià)值。