結核分枝桿菌基因編碼RD1-RD3抗原膠體金法檢測對輔助診斷菌陰肺結核的價值

高德杰，孫義軍，李曉霞，馬 強

（濱州市結核病防治院1.結核科2.檢驗科，山東 濱州 251700）

2010 年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，我國結核病年發病例數約為100 萬，15 歲及以上人群活動性肺結核的患病率為459/10 萬，菌陰肺結核占活動性肺結核的73.5%[1]，結核病的防控形勢依然嚴峻。結核病實驗室診斷一直依賴傳統抗酸桿菌涂片鏡檢和培養技術，但涂片鏡檢的敏感度較差（與獲得痰標本的質量因素密切相關），而培養所需時間較長，不能滿足快速診斷的臨床需要。本研究采用結核分枝桿菌基因編碼RD1-RD3 抗原膠體金法（RD1-RD3 膠體金法）檢測87 例菌陰肺結核患者的晨痰和肺泡灌洗液，觀察其陽性檢出情況，以評價RD1-RD3 膠體金法檢測在診斷菌陰肺結核中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011 年6 月至2022 年6 月在濱州市結核病防治院確診并住院的菌陰肺結核患者87 例為試驗組；其中男性51 例，女性36 例；年齡17 ～64 歲，平均（49.34±8.67）歲。另選取非結核病患者61 例（肺癌23 例、肺炎18 例、支氣管擴張8 例、肺膿腫6 例和支氣管哮喘6 例）為對照組；其中男性39 例，女性22 例；年齡18 ～71 歲，平均（48.76±7.93）歲。兩組病例的性別和年齡相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 菌陰肺結核的診斷標準

菌陰肺結核為3 次痰涂片及1 次培養均陰性的肺結核，其具體診斷標準如下：（1）存在典型肺結核臨床癥狀和胸部X 線表現。（2）抗結核治療有效。（3）臨床可排除其他非結核性肺部疾病。（4）PPD（5U）強陽性，血清抗結核抗體陽性。（5）痰結核菌PCR和探針檢測呈陽性。（6）肺外組織病理證實結核病變。（7）肺泡灌洗液檢出抗酸桿菌。（8）支氣管或肺部組織病理證實結核病變。符合（1）～（6）項中的3 項或（7）、（8）項中的任何1 項可確診[2]。

1.3 標本采集

對照組61 例患者和試驗組87 例患者均留取晨痰1 份；同時試驗組由臨床醫師行電子支氣管鏡肺泡灌洗術，留取肺泡灌洗液至少5 mL 送檢。

1.4 檢測方法

對照組和試驗組患者的晨痰進行GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測。試驗組5 mL 肺泡灌洗液進行涂片、培養、GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測。從5 mL 肺泡灌洗液中吸取0.05 mL 涂片，經抗酸染色鏡檢抗酸桿菌。再取灌洗液2 mL，加入等量4% 氫氧化鈉處理15 分鐘，進行結核分枝桿菌分離培養。另取肺泡灌洗液1 mL 放在防漏的收集器皿中，加入GeneXpert 處理液2 mL，蓋緊劇烈搖動10 ～20次，室溫處理15 分鐘后，用無菌吸管吸取2 mL，加入GeneXpert Cartridge 中的標本孔中，蓋緊蓋子后上機開始檢測。剩余肺泡灌洗液進行RD1-RD3 膠體金法檢測。

1.5 儀器與試劑

GeneXpert MTB/RIF 系統由美國Cepheid 公司生產，試劑盒原裝進口，批號：16201，由天津儀美科技有限公司提供。RD1-RD3 膠體金法試劑由濟南杏恩生物科技有限公司生產。

1.6 結果判定

抗酸染色鏡檢根據涂片抗酸桿菌菌量多少判定為4+、3+、2+、1+、陰性；結核分枝桿菌分離培養根據固體培養基斜面菌量多少判定為4+、3+、2+、1+、陰性；GeneXpert 法結果根據探針的循環閾值（ct 值）判斷，ct 值≤38 即為檢測到結核分枝桿菌，可進一步按照ct 值對結核分枝桿菌進行半定量，ct 值＜16為高含量，ct 值16 ～22 為中含量，ct 值23 ～28 為低含量，ct 值＞28 為極低含量[3]；RD1-RD3 膠體金法的肺泡灌洗液經過試紙條的虹吸后，反應液會向試紙卡上方移動, 待樣品液體虹吸上移并通過C 線位置后，15 分鐘內判讀結果，C 區和T 區同時出現紅線為陽性，僅C 區出現而T 區未出現則為陰性。

1.7 統計學處理

建立Excel 2010 數據庫收集數據，應用SPSS 17.0 軟件進行統計學處理分析，陽性檢出率采用百分比（%）表示，組間結果比較采用χ2 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組和試驗組晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測結果的比較

晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測的特異度分別為100%、96.72%，二者差異無統計學意義（χ2=2.033，P=0.154）；晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測的敏感度分別為13.79%（12/87）和11.49%（10/87），二者差異無統計學意義（χ2=0.208，P=0.648）。詳見表1。

表1 對照組和試驗組晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測的結果（例）

2.2 試驗組肺泡灌洗液四種方法檢測結果的比較

試驗組87 例菌陰肺結核患者肺泡灌洗液涂片、培養、GeneXpert 和RD1-RD3 膠體金法檢測的陽性率分別為10.34%、18.39%、44.83% 和42.53%。結果詳見表2。RD1-RD3 膠體金法與涂片和培養的結果相比，差異均有統計學意義（χ2=23.168、11.965，P=0.000）；RD1-RD3 膠體金法與GeneXpert 法的結果相比，差異無統計學意義（χ2=0.093，P=0.760）。詳見表2。

表2 試驗組87 例患者肺泡灌洗液四種方法檢測的結果[例(%)]

試驗組87 例患者肺泡灌洗液檢測以培養結果為金標準，涂片法的敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率分別為56.25%（9/16）、100%（71/71）、0%（0/71）和43.75%（7/16）。GeneXpert 法的敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率分別為 100%（16/16）、67.61%（48/71）、32.39%（23/71）和0%（0/16）。RD1-RD3膠體金法的敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率分別為100%（16/16）、70.42%（50/71）、29.58%（21/71）和0%（0/16）。詳見表3。

表3 三種方法敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率的分析（例）

2.3 試驗組87 例患者同期晨痰和肺泡灌洗液檢測結果的比較

試驗組87 例患者晨痰和肺泡灌洗液GeneXpert法檢出陽性例數分別為12 例和39 例，兩者比較差異有統計學意義（χ2=20.3448，P=0.000）；RD1-RD3膠體金法檢出陽性例數分別為10 例和37 例，兩者比較差異有統計學意義（χ2=21.251，P=0.000）。

3 討論

菌陰肺結核是指經痰涂片抗酸染色鏡檢和痰結核分枝桿菌分離培養均陰性的肺結核。有研究指出，涂片和培養結核分枝桿菌的陽性或陰性檢出會受到以下因素的影響：（1）標本的質量和性質；（2）病變在肺野的位置；（3）病變是封閉或開放；（4）病變的性質和其中能夠排出的菌量及排出時間間隔；（5）結核分枝桿菌存在的形態；（6）培養標本含有的菌量和是否為活菌；（7）培養前處理的過程中，結核分枝桿菌損傷的程度；（8）培養基營養成分的有限性等[4]。由于菌陰肺結核較難獲得細菌學依據，因此其臨床確診存在較大的難度。

涂片和培養法是實驗室重要的檢測方法，但因敏感度較低，不能滿足臨床的需要。本研究結果顯示，雖然菌陰肺結核痰涂片和培養均陰性，但晨痰經GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測后，其陽性率分別為13.79%（12/87）和11.49%（10/87），肺泡灌洗液的陽性率分別為44.83% 和42.53%，肺泡灌洗液的陽性檢出率顯著高于涂片和培養法結果。患者同期的晨痰和肺泡灌洗液檢測結果相比，肺泡灌洗液的陽性檢出率顯著高于晨痰。可見GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法均具有可檢測含菌量較少標本的優勢，且均具有較高的特異度和敏感度。

結核分枝桿菌基因組學研究顯示，結核分枝桿菌差異區（region of differences,RD）只存在于結核分枝桿菌復合群及其他幾種致病性結核分枝桿菌中，其中RD1-RD3 區編碼蛋白僅存在于致病性結核分枝桿菌中。因此，RD1-RD3 抗原膠體金法對診斷結核病具有較高的特異性和敏感性[5-6]。GeneXpert 技術以半巢式實時定量PCR 技術為基礎，樣品準備、DNA 擴增和檢測完全實現自動化，GeneXpert 對目標DNA 序列的檢測具有高度光學敏感性，實時的光學監測使得軟件可以一經發現目標序列就給出結果。有報道稱，GeneXpert 技術對診斷肺結核和肺外結核均有較高的特異度和敏感度[7-9]。

綜上所述，GeneXpert 法和RD1-RD3 抗原膠體金法均具有較高的特異度和敏感度，但在實際應用中GeneXpert 法所用儀器和試劑盒昂貴，成本較大，而RD1-RD3 抗原膠體金法具有操作簡便、快速，成本較低等優點。因而，RD1-RD3 抗原膠體金法在輔助診斷菌陰肺結核中具有較高的應用價值，且尤其適合在基層結核病防治機構推廣應用。