結(jié)核分枝桿菌基因編碼RD1-RD3抗原膠體金法檢測(cè)對(duì)輔助診斷菌陰肺結(jié)核的價(jià)值

高德杰，孫義軍，李曉霞，馬 強(qiáng)

（濱州市結(jié)核病防治院1.結(jié)核科2.檢驗(yàn)科，山東 濱州 251700）

2010 年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病例數(shù)約為100 萬，15 歲及以上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10 萬，菌陰肺結(jié)核占活動(dòng)性肺結(jié)核的73.5%[1]，結(jié)核病的防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷一直依賴傳統(tǒng)抗酸桿菌涂片鏡檢和培養(yǎng)技術(shù)，但涂片鏡檢的敏感度較差（與獲得痰標(biāo)本的質(zhì)量因素密切相關(guān)），而培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足快速診斷的臨床需要。本研究采用結(jié)核分枝桿菌基因編碼RD1-RD3 抗原膠體金法（RD1-RD3 膠體金法）檢測(cè)87 例菌陰肺結(jié)核患者的晨痰和肺泡灌洗液，觀察其陽性檢出情況，以評(píng)價(jià)RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)在診斷菌陰肺結(jié)核中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011 年6 月至2022 年6 月在濱州市結(jié)核病防治院確診并住院的菌陰肺結(jié)核患者87 例為試驗(yàn)組；其中男性51 例，女性36 例；年齡17 ～64 歲，平均（49.34±8.67）歲。另選取非結(jié)核病患者61 例（肺癌23 例、肺炎18 例、支氣管擴(kuò)張8 例、肺膿腫6 例和支氣管哮喘6 例）為對(duì)照組；其中男性39 例，女性22 例；年齡18 ～71 歲，平均（48.76±7.93）歲。兩組病例的性別和年齡相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)

菌陰肺結(jié)核為3 次痰涂片及1 次培養(yǎng)均陰性的肺結(jié)核，其具體診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）存在典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X 線表現(xiàn)。（2）抗結(jié)核治療有效。（3）臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾病。（4）PPD（5U）強(qiáng)陽性，血清抗結(jié)核抗體陽性。（5）痰結(jié)核菌PCR和探針檢測(cè)呈陽性。（6）肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變。（7）肺泡灌洗液檢出抗酸桿菌。（8）支氣管或肺部組織病理證實(shí)結(jié)核病變。符合（1）～（6）項(xiàng)中的3 項(xiàng)或（7）、（8）項(xiàng)中的任何1 項(xiàng)可確診[2]。

1.3 標(biāo)本采集

對(duì)照組61 例患者和試驗(yàn)組87 例患者均留取晨痰1 份；同時(shí)試驗(yàn)組由臨床醫(yī)師行電子支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)，留取肺泡灌洗液至少5 mL 送檢。

1.4 檢測(cè)方法

對(duì)照組和試驗(yàn)組患者的晨痰進(jìn)行GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)。試驗(yàn)組5 mL 肺泡灌洗液進(jìn)行涂片、培養(yǎng)、GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)。從5 mL 肺泡灌洗液中吸取0.05 mL 涂片，經(jīng)抗酸染色鏡檢抗酸桿菌。再取灌洗液2 mL，加入等量4% 氫氧化鈉處理15 分鐘，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)。另取肺泡灌洗液1 mL 放在防漏的收集器皿中，加入GeneXpert 處理液2 mL，蓋緊劇烈搖動(dòng)10 ～20次，室溫處理15 分鐘后，用無菌吸管吸取2 mL，加入GeneXpert Cartridge 中的標(biāo)本孔中，蓋緊蓋子后上機(jī)開始檢測(cè)。剩余肺泡灌洗液進(jìn)行RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)。

1.5 儀器與試劑

GeneXpert MTB/RIF 系統(tǒng)由美國(guó)Cepheid 公司生產(chǎn)，試劑盒原裝進(jìn)口，批號(hào)：16201，由天津儀美科技有限公司提供。RD1-RD3 膠體金法試劑由濟(jì)南杏恩生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.6 結(jié)果判定

抗酸染色鏡檢根據(jù)涂片抗酸桿菌菌量多少判定為4+、3+、2+、1+、陰性；結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)根據(jù)固體培養(yǎng)基斜面菌量多少判定為4+、3+、2+、1+、陰性；GeneXpert 法結(jié)果根據(jù)探針的循環(huán)閾值（ct 值）判斷，ct 值≤38 即為檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌，可進(jìn)一步按照ct 值對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行半定量，ct 值＜16為高含量，ct 值16 ～22 為中含量，ct 值23 ～28 為低含量，ct 值＞28 為極低含量[3]；RD1-RD3 膠體金法的肺泡灌洗液經(jīng)過試紙條的虹吸后，反應(yīng)液會(huì)向試紙卡上方移動(dòng), 待樣品液體虹吸上移并通過C 線位置后，15 分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，C 區(qū)和T 區(qū)同時(shí)出現(xiàn)紅線為陽性，僅C 區(qū)出現(xiàn)而T 區(qū)未出現(xiàn)則為陰性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

建立Excel 2010 數(shù)據(jù)庫收集數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，陽性檢出率采用百分比（%）表示，組間結(jié)果比較采用χ2 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和試驗(yàn)組晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)結(jié)果的比較

晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)的特異度分別為100%、96.72%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.033，P=0.154）；晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)的敏感度分別為13.79%（12/87）和11.49%（10/87），二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.208，P=0.648）。詳見表1。

表1 對(duì)照組和試驗(yàn)組晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)的結(jié)果（例）

2.2 試驗(yàn)組肺泡灌洗液四種方法檢測(cè)結(jié)果的比較

試驗(yàn)組87 例菌陰肺結(jié)核患者肺泡灌洗液涂片、培養(yǎng)、GeneXpert 和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)的陽性率分別為10.34%、18.39%、44.83% 和42.53%。結(jié)果詳見表2。RD1-RD3 膠體金法與涂片和培養(yǎng)的結(jié)果相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.168、11.965，P=0.000）；RD1-RD3 膠體金法與GeneXpert 法的結(jié)果相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.093，P=0.760）。詳見表2。

表2 試驗(yàn)組87 例患者肺泡灌洗液四種方法檢測(cè)的結(jié)果[例(%)]

試驗(yàn)組87 例患者肺泡灌洗液檢測(cè)以培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，涂片法的敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率分別為56.25%（9/16）、100%（71/71）、0%（0/71）和43.75%（7/16）。GeneXpert 法的敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率分別為 100%（16/16）、67.61%（48/71）、32.39%（23/71）和0%（0/16）。RD1-RD3膠體金法的敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率分別為100%（16/16）、70.42%（50/71）、29.58%（21/71）和0%（0/16）。詳見表3。

表3 三種方法敏感度、特異度、假陽性率和假陰性率的分析（例）

2.3 試驗(yàn)組87 例患者同期晨痰和肺泡灌洗液檢測(cè)結(jié)果的比較

試驗(yàn)組87 例患者晨痰和肺泡灌洗液GeneXpert法檢出陽性例數(shù)分別為12 例和39 例，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.3448，P=0.000）；RD1-RD3膠體金法檢出陽性例數(shù)分別為10 例和37 例，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.251，P=0.000）。

3 討論

菌陰肺結(jié)核是指經(jīng)痰涂片抗酸染色鏡檢和痰結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)均陰性的肺結(jié)核。有研究指出，涂片和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的陽性或陰性檢出會(huì)受到以下因素的影響：（1）標(biāo)本的質(zhì)量和性質(zhì)；（2）病變?cè)诜我暗奈恢茫唬?）病變是封閉或開放；（4）病變的性質(zhì)和其中能夠排出的菌量及排出時(shí)間間隔；（5）結(jié)核分枝桿菌存在的形態(tài)；（6）培養(yǎng)標(biāo)本含有的菌量和是否為活菌；（7）培養(yǎng)前處理的過程中，結(jié)核分枝桿菌損傷的程度；（8）培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的有限性等[4]。由于菌陰肺結(jié)核較難獲得細(xì)菌學(xué)依據(jù)，因此其臨床確診存在較大的難度。

涂片和培養(yǎng)法是實(shí)驗(yàn)室重要的檢測(cè)方法，但因敏感度較低，不能滿足臨床的需要。本研究結(jié)果顯示，雖然菌陰肺結(jié)核痰涂片和培養(yǎng)均陰性，但晨痰經(jīng)GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法檢測(cè)后，其陽性率分別為13.79%（12/87）和11.49%（10/87），肺泡灌洗液的陽性率分別為44.83% 和42.53%，肺泡灌洗液的陽性檢出率顯著高于涂片和培養(yǎng)法結(jié)果。患者同期的晨痰和肺泡灌洗液檢測(cè)結(jié)果相比，肺泡灌洗液的陽性檢出率顯著高于晨痰。可見GeneXpert 法和RD1-RD3 膠體金法均具有可檢測(cè)含菌量較少標(biāo)本的優(yōu)勢(shì)，且均具有較高的特異度和敏感度。

結(jié)核分枝桿菌基因組學(xué)研究顯示，結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)（region of differences,RD）只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其他幾種致病性結(jié)核分枝桿菌中，其中RD1-RD3 區(qū)編碼蛋白僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌中。因此，RD1-RD3 抗原膠體金法對(duì)診斷結(jié)核病具有較高的特異性和敏感性[5-6]。GeneXpert 技術(shù)以半巢式實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，樣品準(zhǔn)備、DNA 擴(kuò)增和檢測(cè)完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，GeneXpert 對(duì)目標(biāo)DNA 序列的檢測(cè)具有高度光學(xué)敏感性，實(shí)時(shí)的光學(xué)監(jiān)測(cè)使得軟件可以一經(jīng)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列就給出結(jié)果。有報(bào)道稱，GeneXpert 技術(shù)對(duì)診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核均有較高的特異度和敏感度[7-9]。

綜上所述，GeneXpert 法和RD1-RD3 抗原膠體金法均具有較高的特異度和敏感度，但在實(shí)際應(yīng)用中GeneXpert 法所用儀器和試劑盒昂貴，成本較大，而RD1-RD3 抗原膠體金法具有操作簡(jiǎn)便、快速，成本較低等優(yōu)點(diǎn)。因而，RD1-RD3 抗原膠體金法在輔助診斷菌陰肺結(jié)核中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，且尤其適合在基層結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。