非酒精性脂肪性肝病與腸道微生態

邱麗瑛,王迎春

隨著肥胖和代謝綜合征(MS)的流行,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發病率逐漸上升,已成為我國最常見的慢性肝病[1]。NAFLD發病機制是基于“二次打擊”假說而提出的“多重打擊”假說[2]。近些年,有新的觀點認為腸道菌群(intestinal microecology,IM)與NAFLD密切相關。在動物模型研究發現,腸道微生態失衡可以導致肝臟脂肪變性、炎癥、甚至肝纖維化等。根據腸-肝軸理論,腸道微生態平衡被破壞時,有害的腸道細菌及其代謝產物能夠通過門脈系統進入肝臟,造成機體免疫應答和炎癥反應,進而導致NAFLD的發生和發展[3]。

1 腸道微生態影響NAFLD發生的機制

腸道微生物群是人體重要的“器官”,受到多種因素的影響,包括遺傳、生活方式、分娩方式、飲食、活動等。腸道微生物群不僅包括腸道細菌,還包括病毒、真菌、少量古細菌和原蟲,其中以細菌占大多數。相比IM,腸道病毒在人體多個系統中的作用方式還未形成明確的共識。目前,真菌中已有布拉酵母菌被用于一些疾病的臨床治療[4,5],但研究仍較少,處于探索階段,因此我們下面重點介紹IM。目前,檢測IM的技術包括16Sr核糖體RNA基因測序、DNA全基因組測序、蛋白質組學、基因組學、代謝組學和液相色譜法等[6]。人類胃腸道中共包括4644種細菌,編碼1.71億個基因。我們發現健康成年人IM主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門。大多數NAFLD/非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者糞便厚壁菌門數量增加,而擬桿菌門數量減少[7]。當腸道微生態結構和功能異常時,可能會影響肝臟代謝,進而促進相關疾病的發生。簡單地說,菌群失調的定義是指正常的IM構成比或數量因多種原因受到破壞。根據腸道和肝臟起源于同一胚層,兩者解剖位置和功能密切相關,因而提出了腸-肝軸理論。它是“雙向性”結構,不僅有害的腸道細菌及產物可以通過門脈系統進入肝臟導致NAFLD,而且肝膽系統不能代謝的物質及細胞炎癥因子也會進入腸腔,加重IM的紊亂[8]。

1.1 腸道屏障功能對NAFLD的影響 在正常情況下,腸道上皮是一道天然屏障,能防止有害的腸道細菌及其代謝產物轉移到血液,為宿主抵御外來有害物質提供主要屏障[9]。但當腸道微生態受到各種因素的攻擊,屏障被破壞,會導致內毒素通過門靜脈系統進入人體血液循環。隨著內毒素持續增高,通過打擊肝臟進而導致NAFLD病程的不斷進展,而當NAFLD發展到一定階段后,又會加重腸道微生態失衡,兩者相互影響,形成惡性循環。上皮緊密連接蛋白對維持上皮屏障完整性至關重要,其功能可受微生物調節,其高水平可防止過量的脂多糖進入腸壁血液,進而阻止腸道黏膜受損和肝臟損傷。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)中丁酸通過上調緊密連接蛋白的表達起到增強腸道屏障的作用。NAFLD的發生與腸道黏膜通透性增加和腸道緊密連接蛋白的表達減少密切相關[10]。物理屏障還包括上皮細胞、免疫細胞和基質細胞,并且不同部位細胞組成亦不同。黏液層、分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)、活性氧、活性氮和各種廣譜抗菌蛋白組成化學屏障,幫助機體抑制病原體和共生體共同發揮作用。粘蛋白是一種高度糖基化的聚合蛋白,有助于將微生物和有害物質從底層的上皮細胞中隔離出來。粘液素降解菌產生的代謝物包括SCFAs和硫酸鹽,有助于維持腸道黏膜和促進屏障功能。屎腸球菌是一種常見的細菌共生體,能夠分泌一種肽聚糖水解酶,能增強腸上皮屏障功能和病原體耐受性,還能激活宿主核苷酸結合低聚結構域蛋白2(NLRP2)信號通路,調節屏障成分的表達,如黏蛋白2、隱窩素2和c型凝集素Reg3 γ。腸道免疫屏障由上皮內淋巴細胞組成,包括T淋巴細胞(CD4+Th17,CD4+T調節細胞)、自然殺傷性T細胞、樹突狀細胞和單核吞噬細胞。自然殺傷性T細胞是識別和區分外來和自身抗原的重要組成部分,當其被抗原呈遞細胞激活后引發免疫反應。它們也可以被促炎性細胞因子激活[11]。腸道黏膜表面共生物誘導的SIgA與微生物和微生物產物結合,可以抵御病原體、維持黏膜平衡和加強屏障功能,從而防止細菌移位。腸腔中的細菌產物如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、多肽、細菌及其產物等通過腸道黏膜層經門靜脈進入肝臟,引起Kupffer細胞大量激活,釋放一系列炎癥因子,加重腸道黏膜和肝臟的損傷[10]。

1.2 腸道微生物代謝產物對NAFLD的影響 膽汁酸作為腸道重要的組成成分,在乳化膳食脂肪、調節脂質代謝和葡萄糖穩態中起到正向作用,能夠抑制腸道細菌的過度生長,并且IM中的擬桿菌門和厚壁菌門能夠作用于膽汁酸代謝。膽汁酸代謝是指初級膽汁酸經脫羥基等一系列反應,最終生成次級膽汁酸的過程[12],這個代謝過程需要的多種限速酶由腸道細菌合成。一般來說,腸道通透性的提高和細菌移位有可能使微生物的代謝產物通過門脈系統到達肝臟,從而導致膽汁酸代謝障礙。膽汁酸具有生物清潔劑的作用,可以溶解膽汁中的膽固醇和脂類。研究表明,膽汁酸又可作為激素樣信號分子激活法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶聯受體5(TGR5),誘導成纖維細胞生長因子19轉錄,進而抑制膽固醇7ɑ-單氧酶抑制膽汁酸的合成。膽汁酸增多會通過激活TGR5,影響肝臟糖脂代謝,進而導致炎癥和纖維化。由于膽汁酸是由胃腸道中的微生物代謝的,因此細菌的變化可以影響膽汁酸的代謝轉化,從而引起肝臟的炎癥和胰島素抵抗(IR)。

腸道內膳食纖維能夠促進腸道蠕動而無法被降解吸收。當腸道微生態紊亂時,膳食纖維在發揮促進腸道蠕動功能的同時,又被纖維素分解性細菌產生的纖維素酶和其他酶部分降解為一系列單糖及其磷酸化產物,通過增加腸道熱量的攝入,為機體供能并促進肝內脂質合成,導致肝內脂肪堆積,促進細胞代謝和生長,調節腸道pH值等。研究表明,SCFAs主要通過激活GPR41/43或通過抑制組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1,HDAC1)發揮其生物學功能。相關動物實驗表明,GPR41/43參與了脂質代謝和免疫功能調節,而其過表達可以引起IR和血脂異常[13]。研究表明,SCFAs在NAFLD中起到增強腸道屏障功能、增強脂質氧化等有益的作用。腸道SCFAs中大部分為乙酸、丙酸和丁酸,其中丁酸是最強的HDAC1抑制劑,具有調節肝臟脂代謝的作用。一項動物研究觀察到,應用丁酸喂養小鼠后,能夠影響小鼠腸道代謝,得出結論認為增加產丁酸鹽的菌群將有助于減輕肝臟脂肪變性和肝臟炎癥反應[14]。

當腸道微生態紊亂時,某些特殊菌落占優勢,會大量增加產乙醇菌,如HiAlc-Kpn和溶細胞素陽性糞腸球菌,還會產生大量的內源性乙醇,而腸道微生態被破壞后,損壞的腸黏膜屏障會使更多的乙醇進入血液循環。過量的內源性乙醇最終會超出肝臟的代謝能力,除直接損傷腸黏膜屏障外,還能增加肝臟活性氧自由基生成,導致肝臟氧化應激水平升高,促進肝臟脂肪變[15]。乙醇的代謝副產品乙醛也可通過減弱腸道屏障導致細菌移位和內毒素血癥。一旦腸道屏障被破壞,有害物質和毒素便會源源不斷地進入血液循環,從而引起炎癥反應,釋放各種炎性介質和細胞因子等。同時,門靜脈LPS水平不斷升高,激活Toll樣受體4(Toll-like receptor, TLR4),引發進一步的炎癥反應。

膽堿是細胞膜磷脂的重要組成成分,能夠避免肝臟脂質沉積,在從肝臟轉運出脂質時發揮重要作用。研究證實,當飲食中缺乏膽堿時,肝內無法合成磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC),而PC缺乏既會影響極低密度脂蛋白的分泌和組裝,也會促進脂肪酸合成,增加體內甘油三酯合成,最終導致肝臟脂肪堆積[16]。當IM平衡被打破,膽堿代謝菌數量增加,產生微生物復合酶,催化膽堿轉化為多種胺類物質。一方面,導致體內膽堿數量和保護性因素減少,最終引起肝臟脂肪變性;另一方面,胺類物質可在肝臟中被代謝為三甲胺-N-氧化物(TMAO)。甲胺本身具有毒性,長期作用會使人體受到傷害。同時,甲胺在被肝臟攝取代謝過程中可影響糖脂代謝,從而誘發肝臟炎癥反應[17]。

1.3 腸道微生態與炎性反應和IR 研究表明,當腸道微生態紊亂時,IM中擬桿菌門和厚壁菌門比例降低,產生內毒素的細菌增加,最終引起的腸源性內毒素血癥能夠誘導IR的發生。IR不僅會損害糖原合成,擾亂血糖水平,還能通過氧化應激反應和脂質過氧化機制等共同參與NAFLD的形成和發展。LPS是從腸道革蘭氏陰性細菌中釋放出來的毒素,能夠刺激炎癥反應,引起肝損傷。內毒素血癥對抗原CD14系統上的LPS-TLR4單核細胞分化起作用,能激活JNK和NF-κB途徑,作用于肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)和Kupffer細胞,進一步破壞腸道通透性和降低肝臟的胰島素敏感性。肝臟是第一過濾器,能夠濾過胃腸道微生物群代謝產物,如內毒素、LPS、鞭毛蛋白、脂磷壁酸、肽聚糖和細菌DNA等,激活TLR4和Nod樣受體(NLR)。TLR4的活化導致促炎、抗病毒和抗菌細胞因子的產生。許多研究表明,LPS/TLR4信號通路介導炎癥、氧化應激、IR和肝纖維化,是NAFLD組織病理學發生的關鍵[18]。目前,發現TLRs激活后可啟動核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途徑,誘導IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 、α-干擾素等表達,導致脂肪組織巨噬細胞浸潤,TNF-α產量增加,胰島素敏感性逐漸降低。同時,啟動適應性免疫應答信號,激活促炎因子,進一步加重患者腸道黏膜屏障的破壞,并使得患者的腸源性內毒素血癥不斷加重,誘導肝細胞損傷、HSC激活、IR和微循環紊亂,加重IM失調,形成惡性循環,從而加重NAFLD患者的病情[19]。

2 基于調節IM的治療NAFLD方法

動物實驗研究證實,飲食和運動療法可使腸道微生物系統的組成發生變化,導致有益菌豐度上升,有害菌豐度下降,從而改善胰島素敏感性以及脂肪酸和葡萄糖的降解,減少肝臟脂肪含量,進而減緩NAFLD的病情進展[20,21]。近些年,從調節腸道微生態的角度來治療NAFLD也受到極大關注,已有一些研究證實使用微生態制劑和糞菌移植等方法治療NAFLD是有效的[22]。

2.1 微生態制劑 微生態制劑治療已成為一種新穎、安全和有效的方法。多項動物實驗研究表明,在脂肪肝小鼠,益生菌、益生元、合生元和腸道功能性代謝產物等都具有顯著的治療效果[23]。益生菌被世界衛生組織定義為一種“當劑量足夠時,對宿主健康是有益的活微生物”。目前,乳酸桿菌和雙歧桿菌菌株是功能食品和膳食補充劑中使用最廣泛的益生菌,但下一代益生菌,如普拉梭菌、嗜黏蛋白阿克曼菌或梭狀芽孢桿菌菌株也顯示出有明確的應用前景。VSL#3和改良的VSL#3是乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌的益生菌的混合物,已被證實對NAFLD具有保護作用,后者能通過下調TGF-β信號改善肝纖維化,抑制炎癥途徑絲氨酸蘇氨酸激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和NF-κB的作用[24]。在NASH動物模型,植物乳桿菌NA136通過刺激AMPK途徑磷酸化ACC、抑制SREBP-1/FAS信號和刺激核因子E2相關因子2(AMPK/NF-E2-related factor 2,Nrf2)信號通路,從而達到減少脂肪生成、增強脂肪酸氧化,降低肝臟氧化應激作用。植物乳桿菌NA136已被證明可以減少高脂喂養和果糖喂養的NAFLD大鼠肝臟脂肪組織,并降低肝酶水平。副干酪乳桿菌、普拉梭菌、嗜黏蛋白阿克曼菌等可以起到減輕脂肪組織炎癥,改善代謝參數等作用。一些益生菌組合制劑已顯示出免疫調節潛力,包括增強抗炎細胞因子(IL-10)的產生,減少促炎趨化因子(IL-6、IL-8、CXCL 10和單核細胞趨化蛋白1)的產生。然而,益生菌組合的數據很難解釋,因為不同益生菌的使用劑量和比例不同,同時還有其他影響因素需要考慮,如治療的持續時間以及停藥后數據收集時間等[20]。

益生元是食物中誘導微生物生長的化合物,在微生物群的代謝作用下,起到促進有益細菌生長的作用。多數資料表明益生元主要包括菊粉型果聚糖和低聚半乳糖,可能對NAFLD和NASH都有益處。益生元能夠更好地控制普氏糞桿菌和雙歧桿菌的生長,降低血清LPS水平,這是由于胰高血糖素樣肽(GLP)-1的增加和GLP-2介導的腸道屏障完整性的營養效應而發揮作用。在肥胖患者,補充低聚果糖可通過調節胃饑餓素和肽YY等食欲激素誘導體質量減輕,減少患者肝臟炎癥并改善代謝參數[25]。益生元治療已被證明是一種能夠恢復正常IM的有效療法,但它可能需要與其他干預措施結合使用,以改善病情。合生元是益生元和益生菌的組合,可用于取代功能失調的IM。一項關于NAFLD患者補充益生菌、益生元和合生元治療的meta分析提示其能引起體質指數顯著下降和肝酶的改善[25]。后生素是指由細菌死亡溶解或活菌代謝分泌釋放的可溶性因子,包括SCFAs、各種細菌素、維生素類、多肽、胞外多糖等,具有免疫調節及腸道屏障保護等作用。關于后生素治療NAFLD患者的療效研究還很少,主要限于科研研究。在老年小鼠,應用熱滅活副干酪乳桿菌D3-5中的脂磷壁酸可使腸道內阿克曼氏菌豐度增加,粘蛋白顯著表達,增強黏膜屏障功能,能預防高脂飲食喂養引起的代謝功能障礙[11,26]。

2.2 糞便微生物群移植(faecal microbiota transplantation,FMT) FMT是指將健康供體的腸道微生物菌群移植到患者腸道內,全面地調節患者IM,是重建IM的核心技術,涉及將健康個體糞便中的功能性微生物群轉移到NAFLD患者的胃腸道中[27]。一項臨床試驗評估口服微生物組(SER-109)治療復發性艱難梭菌感染的療效,與安慰劑組相比,給予SER-109組顯示出預防復發感染的卓越能力[28]。應用確定的微生物群落或微生物代謝物進行合理的治療是可以起到治療作用的。動物實驗表明,對NASH小鼠進行FMT可以顯著降低體質量、體脂含量和血清轉氨酶水平[29]。FMT可以改善IM紊亂,從而減少脂肪聚集,緩解肝臟脂肪變程度[30]。FMT可恢復腸道菌群多樣性,增加擬桿菌門數量,減少放線菌門和厚壁菌門數量,促進丁酸鹽產生,改善緊密連接功能和內毒素血癥。FMT確實有降低NAFLD患者小腸通透性的潛力[31,32]。來自瘦型捐贈者的FMT改善了胰島素敏感性[33]。FMT能夠改善NAFLD患者肝組織脂肪變、腸黏膜屏障功能、脂肪代謝和IM譜等[29]。移植的健康IM的豐度和種屬是否與疾病緩解程度呈正相關還有待進一步研究。當前,FMT還面臨許多挑戰。菌群供者究竟是從標準糞菌庫中選擇還是采用個體供者?將特征不明顯的微生物材料引入患者體內是否存在風險,其中可能包括致病菌。未來還需要對提取方法、儲存、給藥和后期穩定性等進行大量研究。

2.3 噬菌體 腸道噬菌體是存在于人體腸道中的微生物,與IM相互調節發揮作用。通過研究細菌豐度及其組成變化,可使用特定細菌的噬菌體靶向根除該細菌,消除其對NAFLD患者的不利影響[34]。例如HiAlc-Kpn作為產乙醇菌,使用噬菌體靶向根除HiAlc-Kpn,便可以有效緩解NAFLD大鼠的疾病程度。研究表明,噬菌體在FMT治療腸道相關疾病方面可能起著重要的作用,為精確修飾IM提供了一種可靠的方法。

2.4 中草藥 中醫自古有“肝與大腸相通”的說法。中醫藥調節NAFLD最常用的是具有清熱、祛濕、補氣等功效的中藥,最具代表性的是黃連和人參,其有效成分分別為小檗堿和人參皂苷。動物實驗研究發現,小檗堿能夠改善NAFLD大鼠IM結構和菌屬比例,增加腸黏膜上皮occludin蛋白表達,并通過激活膽汁酸受體及其通路相關蛋白表達,促進膽汁酸肝腸循環,最終起到調節IM和延緩NAFLD進程的作用[8]。采取宏基因測序法研究長期服用人參提取物的大鼠IM的變化,結果顯示人參提取物能夠增加腸道的有益菌群,而抑制有害菌群,從而通過調整IM來改善NAFLD的病情[35]。長期使用中草藥或聯合西藥使用中草藥也可能更好,將非常有助于開發新的中草藥療法或新的藥物以改善NAFLD。