氣相色譜法測定穩(wěn)定同位素13 C 標記辛酸純度的不確定度評定*

趙 誠, 孫 雯, 袁璋晶

(上海化工研究院有限公司/上海市穩(wěn)定同位素檢測及應(yīng)用研發(fā)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺 上海 200062)

13C 穩(wěn)定同位素是一種無放射性的示蹤劑,廣泛應(yīng)用于與人類健康息息相關(guān)的各個領(lǐng)域中,如農(nóng)業(yè)科學(xué)、生態(tài)環(huán)境、醫(yī)學(xué)及臨床診斷等。 近年來,以13C 穩(wěn)定同位素作為示蹤劑的同位素示蹤技術(shù)越來越多地應(yīng)用于研究全球氣候變化和土壤碳動態(tài)變化中[1]。 在農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域,國內(nèi)外許多專家利用13C 穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)解釋了土壤中有機氮的動態(tài)變化過程,探索土壤團聚體固氮機理及研究土壤固氮潛力[2-4]。 在生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域,同位素示蹤技術(shù)是解釋陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要工具。 在醫(yī)學(xué)與臨床診斷領(lǐng)域,隨著對13C 呼氣試驗所開展的臨床診斷與研究,使13C 標記化合物的應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛[5-7]。 目前,我國穩(wěn)定同位素標記技術(shù)飛速發(fā)展,相應(yīng)的檢測技術(shù)也日趨完善與普及,越來越多的13C 呼氣試劑應(yīng)用于臨床試驗中,其非創(chuàng)傷性的優(yōu)點[8]已成為核醫(yī)學(xué)診斷的重要工具之一,在臨床診斷中的應(yīng)用前景廣闊。

13C 標記的辛酸作為呼氣試劑應(yīng)用于胃固體排空及消化功能的測試[9-12],試驗中所使用的13C標記辛酸大多從國外進口,質(zhì)量評價方法的缺乏成為限制我國高端試劑自主化生產(chǎn)的瓶頸。 行業(yè)標準《穩(wěn)定同位素13C 標記的辛酸》(HG/T 5941—2021)[13]于2022 年4 月正式實施,該標準推薦了13C 標記辛酸化學(xué)純度及同位素豐度的檢測方法,對國產(chǎn)化穩(wěn)定同位素標記辛酸產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。 本文依據(jù)測量不確定度評定規(guī)范及準則[14-16],通過對13C 標記辛酸化學(xué)純度測定過程中各不確定度的來源進行分析,建立了采用氣相色譜法進行穩(wěn)定同位素13C 標記辛酸化學(xué)純度不確定度評定的方法,以期為提升檢測結(jié)果的準確性和可靠性提供參考。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器:7890A 型氣相色譜儀,美國Agilent 公司; MSA225S 型電子天平, 德國Sartorius 公司。

主要試劑:辛酸標準品,純度(質(zhì)量分數(shù),下同)為99.2%,德國Dr. Ehrenstorfer 公司;13C 標記辛酸,純度為99.1%,上海化工研究院有限公司;丙酮,色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 測定條件

色譜柱:HP-5 柱,30 m×0.25 mm,0.5 μm;進樣方法:分流進樣,分流比為10 ∶1;進樣口溫度:250 ℃;載氣:N2;載氣流量:1.0 mL/min;檢測器:氫火焰離子化檢測器(FID);檢測器溫度:250 ℃;H2流量:30 mL/min;空氣流量:400 mL/min;色譜柱溫度:50 ℃保持1 min,以40 ℃/min 升溫至230 ℃保持5 min;進樣量:1 μL。

1.3 試驗步驟

1.3.1 標準儲備溶液的配制

準確稱取250 mg(精確到0.01 mg)辛酸標準品于25 mL 容量瓶中,用丙酮溶解后稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度10 mg/mL 的標準儲備溶液。

1.3.2 系列標準工作溶液的配制

將1.3.1 配制的標準儲備溶液用丙酮稀釋,得到質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mg/mL的系列標準工作溶液。

1.3.3 標準工作曲線的建立

將1.3.2 配制的系列標準工作溶液用微孔濾膜過濾后進行氣相色譜分析,各標準工作溶液重復(fù)測定3 次。 以標準工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標,以3 次測得的峰面積的平均值為縱坐標,繪制標準工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備

準確稱取20 mg(精確到0.01 mg)13C 標記辛酸樣品于10 mL 容量瓶中,用丙酮溶解后稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 的樣品溶液。

1.3.5 樣品溶液的測定

將1.3.4 制備的樣品溶液用微孔濾膜過濾后,依據(jù)HG/T 5941—2021,采用氣相色譜法進行化學(xué)純度測定。 每份試液重復(fù)測定3 次,計算3 次測得的峰面積的平均值,根據(jù)標準工作曲線得到試液的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

13C 標記辛酸樣品的純度w用質(zhì)量分數(shù)表示,按式(1)計算:

式中:w——13C 標記辛酸樣品純度,%;

ρ——13C 標記辛酸樣品的峰面積平均值在標準工作曲線上對應(yīng)的質(zhì)量濃度,mg/mL;

V——13C 標記辛酸樣品的定容體積,mL;

wS——辛酸標準品標注純度,%;

k——13C 標記辛酸與天然豐度辛酸標準品的質(zhì)量校正系數(shù),取值1.01;

m——13C 標記辛酸樣品的稱樣量,mg。

2.2 不確定度的來源分析

從數(shù)學(xué)模型、樣品制備過程等方面分析,同時參考各類不確定度評定文獻[17-19],確定氣相色譜法測定13C 標記辛酸樣品純度的不確定度主要來源為: ①標準溶液配制及檢測過程,包括標準品稱樣量、標準溶液制備、標準品純度、標準曲線擬合等;②樣品溶液配制及檢測過程,包括樣品稱樣量、樣品溶液制備、樣品重復(fù)測量等。

2.3 不確定度分量評定

2.3.1 標準溶液配制及檢測過程引入的相對標準不確定度urel(1)

(1)標準品稱量引入的相對標準不確定度urel(m1)

采用精度為0.01 mg 的分析天平稱取250.32 mg 辛酸標準品,天平檢定證書給出的最大允許誤差為±0.3 mg,根據(jù)矩形分布計算,標準不確定度u(m1)= 0.3/ 3=0.173 2(mg),相對標準不確定度urel(m1) = 0.173 2/250.32 =0.000 692。

(2)標準溶液制備過程引入的相對標準不確定度urel(V1)

標準溶液制備過程引入的不確定度,主要來源于容量瓶、分度吸量管的允許誤差及溶液制備過程中溫度的變化。 依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》(JJG 196—2006)[20]所提供的允許誤差,按三角分布,取k= 6,計算容量瓶、分度吸量管引入的不確定度;進行試驗時,實驗室溫度在(20±4) ℃范圍內(nèi)波動,取水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃,按矩形分布進行計算,見表1。

表1 標準溶液配制引入的不確定度

根據(jù)表1 中各分量的相對標準不確定度,計算標準溶液制備過程引入的合成相對標準不確定度urel(V1):

(3)標準品純度引入的相對標準不確定度urel(w1)

辛酸標準品證書顯示其純度為99.2%,不確定度為0.005,則標準品引入的標準不確定度為u(w1)= 0.005/2=0.002 5,相對標準不確定度urel(w1)= 0.002 5/0.992=0.002 520。

(4)標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(L)

將1.3.2 配制的系列標準工作溶液重復(fù)測定3 次,采用最小二乘法對測得的峰面積平均值y與辛酸的質(zhì)量濃度x進行擬合,線性方程及不確定度見表2。 辛酸標準溶液峰面積的剩余標準偏差Sy采用式(2)進行計算,標準曲線擬合引入的不確定度按式(3)計算。

式中:yi——辛酸系列標準工作溶液的峰面積;

ρi——辛酸系列標準工作溶液的質(zhì)量濃度,mg/mL;

a——線性方程中的斜率;

b——線性方程中的截距;

n——辛酸系列標準工作溶液重復(fù)測定次數(shù),取值15。

式中:ρ0——被測樣品質(zhì)量濃度,取值2.076,mg/mL;

——辛酸系列標準工作溶液的質(zhì)量濃度的平均值,mg/mL;

p——13C 標記辛酸樣品測定次數(shù),取值3。

稱取20.76 mg13C 標記辛酸樣品于10 mL 容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為2.076 mg/mL 的樣品溶液,標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為:

標準溶液的配制及檢測過程引入的相對標準不確定度urel(1)由urel(m1)、urel(V1)、urel(w1)、urel(L)進行合成,即:

2.3.2 樣品溶液配制及檢測過程引入的相對標準不確定度urel(2)

(1) 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(m2)

采用精度為0.01 mg 的分析天平稱取20.76 mg13C 標記辛酸樣品,最大允許誤差為±0.08 mg,根據(jù)矩形分布計算,標準不確定度u(m2)=0.08/=0.046 2(mg),則相對標準不確定度urel(m2)=0.046 2/20.76=0.002 225。

(2)樣品溶液制備過程引入的相對標準不確定度urel(V2)

樣品溶液采用10 mL 容量瓶配制(使用1 次),10 mL 容量瓶允許誤差為±0.020 mL,按三角分布,取k=,則標準不確定度為0.020/=0.008 2(mL)。 進行試驗時,實驗室溫度在(20±4) ℃范圍內(nèi)波動,取水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃,按矩形分布進行計算,溶液膨脹標準不確定度為(10×2.1×10-4×4)/=0.004 8(mL),樣品溶液制備過程中相對標準不確定度

(3)樣品檢測重復(fù)性引入的相對標準不確定度urel(R)

重復(fù)稱取13C 標記辛酸樣品6 次,在相同條件下進行檢測,其化學(xué)純度分別為98.7%、99.3%、98.8%、98.9%、 98.7%、 99.4%, 平均純度為99.0%,標準偏差為0.281%,則標準不確定度u(R)= 0.002 81/ 6 =0.001 1,樣品檢測重復(fù)性引入的相對標準不確定度為urel(R)= 0.001 1/0.99=0.001 111。

樣品溶液配制及檢測過程引入的相對標準不確定度urel(2)由urel(m2)、urel(V2)、urel(R)進行合成,即:

2.4 合成相對標準不確定度urel(X)

氣相色譜法測定穩(wěn)定同位素13C 標記辛酸化學(xué)純度的合成相對標準不確定度為:

試驗測得13C 標記辛酸化學(xué)純度平均值X為99.0%,則u(X) =urel(X) ×X= 0.008 254 ×99.0%=0.817%。

2.5 擴展不確定度U(X)和測量結(jié)果的表示

在95%的置信度下,包含因子k=2,擴展不確定度U(X)=k×u(X)= 2×0.817%=1.6%。

當測得穩(wěn)定同位素13C 標記辛酸化學(xué)純度為99.0%時,其結(jié)果可表示為99.0%±1.6%。

3 結(jié)語

本研究采用氣相色譜法測定穩(wěn)定同位素13C標記辛酸化學(xué)純度,并對定量分析過程中可能產(chǎn)生的不確定度分量的來源進行分析、評定。 由結(jié)果可知,辛酸標準溶液配制及標準曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度較大,在實際樣品的檢測中,可通過提高儀器的穩(wěn)定性和分析人員的操作熟練程度,減小標準曲線擬合引入的不確定度。