氣相色譜法測(cè)定穩(wěn)定同位素13 C 標(biāo)記辛酸純度的不確定度評(píng)定*

趙 誠(chéng), 孫 雯, 袁璋晶

(上?；ぱ芯吭河邢薰?上海市穩(wěn)定同位素檢測(cè)及應(yīng)用研發(fā)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái) 上海 200062)

13C 穩(wěn)定同位素是一種無(wú)放射性的示蹤劑,廣泛應(yīng)用于與人類健康息息相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域中,如農(nóng)業(yè)科學(xué)、生態(tài)環(huán)境、醫(yī)學(xué)及臨床診斷等。 近年來(lái),以13C 穩(wěn)定同位素作為示蹤劑的同位素示蹤技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于研究全球氣候變化和土壤碳動(dòng)態(tài)變化中[1]。 在農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域,國(guó)內(nèi)外許多專家利用13C 穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)解釋了土壤中有機(jī)氮的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,探索土壤團(tuán)聚體固氮機(jī)理及研究土壤固氮潛力[2-4]。 在生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域,同位素示蹤技術(shù)是解釋陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要工具。 在醫(yī)學(xué)與臨床診斷領(lǐng)域,隨著對(duì)13C 呼氣試驗(yàn)所開(kāi)展的臨床診斷與研究,使13C 標(biāo)記化合物的應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛[5-7]。 目前,我國(guó)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)飛速發(fā)展,相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)也日趨完善與普及,越來(lái)越多的13C 呼氣試劑應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中,其非創(chuàng)傷性的優(yōu)點(diǎn)[8]已成為核醫(yī)學(xué)診斷的重要工具之一,在臨床診斷中的應(yīng)用前景廣闊。

13C 標(biāo)記的辛酸作為呼氣試劑應(yīng)用于胃固體排空及消化功能的測(cè)試[9-12],試驗(yàn)中所使用的13C標(biāo)記辛酸大多從國(guó)外進(jìn)口,質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的缺乏成為限制我國(guó)高端試劑自主化生產(chǎn)的瓶頸。 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《穩(wěn)定同位素13C 標(biāo)記的辛酸》(HG/T 5941—2021)[13]于2022 年4 月正式實(shí)施,該標(biāo)準(zhǔn)推薦了13C 標(biāo)記辛酸化學(xué)純度及同位素豐度的檢測(cè)方法,對(duì)國(guó)產(chǎn)化穩(wěn)定同位素標(biāo)記辛酸產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。 本文依據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定規(guī)范及準(zhǔn)則[14-16],通過(guò)對(duì)13C 標(biāo)記辛酸化學(xué)純度測(cè)定過(guò)程中各不確定度的來(lái)源進(jìn)行分析,建立了采用氣相色譜法進(jìn)行穩(wěn)定同位素13C 標(biāo)記辛酸化學(xué)純度不確定度評(píng)定的方法,以期為提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器:7890A 型氣相色譜儀,美國(guó)Agilent 公司; MSA225S 型電子天平, 德國(guó)Sartorius 公司。

主要試劑:辛酸標(biāo)準(zhǔn)品,純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)為99.2%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司;13C 標(biāo)記辛酸,純度為99.1%,上海化工研究院有限公司;丙酮,色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 測(cè)定條件

色譜柱:HP-5 柱,30 m×0.25 mm,0.5 μm;進(jìn)樣方法:分流進(jìn)樣,分流比為10 ∶1;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣:N2;載氣流量:1.0 mL/min;檢測(cè)器:氫火焰離子化檢測(cè)器(FID);檢測(cè)器溫度:250 ℃;H2流量:30 mL/min;空氣流量:400 mL/min;色譜柱溫度:50 ℃保持1 min,以40 ℃/min 升溫至230 ℃保持5 min;進(jìn)樣量:1 μL。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取250 mg(精確到0.01 mg)辛酸標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL 容量瓶中,用丙酮溶解后稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.3.2 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

將1.3.1 配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用丙酮稀釋,得到質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

將1.3.2 配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行氣相色譜分析,各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測(cè)定3 次。 以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以3 次測(cè)得的峰面積的平均值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.4 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取20 mg(精確到0.01 mg)13C 標(biāo)記辛酸樣品于10 mL 容量瓶中,用丙酮溶解后稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 的樣品溶液。

1.3.5 樣品溶液的測(cè)定

將1.3.4 制備的樣品溶液用微孔濾膜過(guò)濾后,依據(jù)HG/T 5941—2021,采用氣相色譜法進(jìn)行化學(xué)純度測(cè)定。 每份試液重復(fù)測(cè)定3 次,計(jì)算3 次測(cè)得的峰面積的平均值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到試液的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

13C 標(biāo)記辛酸樣品的純度w用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示,按式(1)計(jì)算:

式中:w——13C 標(biāo)記辛酸樣品純度,%;

ρ——13C 標(biāo)記辛酸樣品的峰面積平均值在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度,mg/mL;

V——13C 標(biāo)記辛酸樣品的定容體積,mL;

wS——辛酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)注純度,%;

k——13C 標(biāo)記辛酸與天然豐度辛酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量校正系數(shù),取值1.01;

m——13C 標(biāo)記辛酸樣品的稱樣量,mg。

2.2 不確定度的來(lái)源分析

從數(shù)學(xué)模型、樣品制備過(guò)程等方面分析,同時(shí)參考各類不確定度評(píng)定文獻(xiàn)[17-19],確定氣相色譜法測(cè)定13C 標(biāo)記辛酸樣品純度的不確定度主要來(lái)源為: ①標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及檢測(cè)過(guò)程,包括標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備、標(biāo)準(zhǔn)品純度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等;②樣品溶液配制及檢測(cè)過(guò)程,包括樣品稱樣量、樣品溶液制備、樣品重復(fù)測(cè)量等。

2.3 不確定度分量評(píng)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(1)

(1)標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m1)

采用精度為0.01 mg 的分析天平稱取250.32 mg 辛酸標(biāo)準(zhǔn)品,天平檢定證書(shū)給出的最大允許誤差為±0.3 mg,根據(jù)矩形分布計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m1)= 0.3/ 3=0.173 2(mg),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m1) = 0.173 2/250.32 =0.000 692。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過(guò)程引入的不確定度,主要來(lái)源于容量瓶、分度吸量管的允許誤差及溶液制備過(guò)程中溫度的變化。 依據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》(JJG 196—2006)[20]所提供的允許誤差,按三角分布,取k= 6,計(jì)算容量瓶、分度吸量管引入的不確定度;進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),實(shí)驗(yàn)室溫度在(20±4) ℃范圍內(nèi)波動(dòng),取水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃,按矩形分布進(jìn)行計(jì)算,見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

根據(jù)表1 中各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液制備過(guò)程引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1):

(3)標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(w1)

辛酸標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)顯示其純度為99.2%,不確定度為0.005,則標(biāo)準(zhǔn)品引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(w1)= 0.005/2=0.002 5,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(w1)= 0.002 5/0.992=0.002 520。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)

將1.3.2 配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測(cè)定3 次,采用最小二乘法對(duì)測(cè)得的峰面積平均值y與辛酸的質(zhì)量濃度x進(jìn)行擬合,線性方程及不確定度見(jiàn)表2。 辛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差Sy采用式(2)進(jìn)行計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度按式(3)計(jì)算。

式中:yi——辛酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積;

ρi——辛酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度,mg/mL;

a——線性方程中的斜率;

b——線性方程中的截距;

n——辛酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測(cè)定次數(shù),取值15。

式中:ρ0——被測(cè)樣品質(zhì)量濃度,取值2.076,mg/mL;

——辛酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度的平均值,mg/mL;

p——13C 標(biāo)記辛酸樣品測(cè)定次數(shù),取值3。

稱取20.76 mg13C 標(biāo)記辛酸樣品于10 mL 容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為2.076 mg/mL 的樣品溶液,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(1)由urel(m1)、urel(V1)、urel(w1)、urel(L)進(jìn)行合成,即:

2.3.2 樣品溶液配制及檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(2)

(1) 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m2)

采用精度為0.01 mg 的分析天平稱取20.76 mg13C 標(biāo)記辛酸樣品,最大允許誤差為±0.08 mg,根據(jù)矩形分布計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m2)=0.08/=0.046 2(mg),則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m2)=0.046 2/20.76=0.002 225。

(2)樣品溶液制備過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)

樣品溶液采用10 mL 容量瓶配制(使用1 次),10 mL 容量瓶允許誤差為±0.020 mL,按三角分布,取k=,則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.020/=0.008 2(mL)。 進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),實(shí)驗(yàn)室溫度在(20±4) ℃范圍內(nèi)波動(dòng),取水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃,按矩形分布進(jìn)行計(jì)算,溶液膨脹標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(10×2.1×10-4×4)/=0.004 8(mL),樣品溶液制備過(guò)程中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(3)樣品檢測(cè)重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

重復(fù)稱取13C 標(biāo)記辛酸樣品6 次,在相同條件下進(jìn)行檢測(cè),其化學(xué)純度分別為98.7%、99.3%、98.8%、98.9%、 98.7%、 99.4%, 平均純度為99.0%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.281%,則標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(R)= 0.002 81/ 6 =0.001 1,樣品檢測(cè)重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(R)= 0.001 1/0.99=0.001 111。

樣品溶液配制及檢測(cè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(2)由urel(m2)、urel(V2)、urel(R)進(jìn)行合成,即:

2.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

氣相色譜法測(cè)定穩(wěn)定同位素13C 標(biāo)記辛酸化學(xué)純度的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

試驗(yàn)測(cè)得13C 標(biāo)記辛酸化學(xué)純度平均值X為99.0%,則u(X) =urel(X) ×X= 0.008 254 ×99.0%=0.817%。

2.5 擴(kuò)展不確定度U(X)和測(cè)量結(jié)果的表示

在95%的置信度下,包含因子k=2,擴(kuò)展不確定度U(X)=k×u(X)= 2×0.817%=1.6%。

當(dāng)測(cè)得穩(wěn)定同位素13C 標(biāo)記辛酸化學(xué)純度為99.0%時(shí),其結(jié)果可表示為99.0%±1.6%。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究采用氣相色譜法測(cè)定穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記辛酸化學(xué)純度,并對(duì)定量分析過(guò)程中可能產(chǎn)生的不確定度分量的來(lái)源進(jìn)行分析、評(píng)定。 由結(jié)果可知,辛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度較大,在實(shí)際樣品的檢測(cè)中,可通過(guò)提高儀器的穩(wěn)定性和分析人員的操作熟練程度,減小標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。