食品中米酵菌酸檢測方法研究進展

蔡 潔，羅 琳，劉栩曄，姚慶偉，周偉乾，黃奕佳

（汕頭市檢驗檢測中心，廣東汕頭 515000）

近年來，我國南方地區頻發濕米粉中毒的公共衛生事件，其誘因在于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌污染食品基質并產生米酵菌酸[1]。米酵菌酸是一種長鏈脂肪酸結構的細菌毒素，常見于發酵或變質谷物、濕米粉和銀耳等食品中且具有很強的急性毒性，嚴重時可迅速引起肝腎損傷并導致全身多器官功能衰竭[2-3]。SHI等[4]提出，米酵菌酸可抑制線粒體內膜的腺嘌呤核苷酸轉運蛋白（ANT）在ADP磷酸化和ATP水解過程發揮正常作用，通過代謝過程反復損害肝臟、腎臟等器官，影響機體糖類或脂肪代謝、蛋白質合成、凝血功能、體液循環等基礎功能，在此期間中毒者體內可能因ATP轉運或利用受阻引發肝臟和肌糖原的代償機制并出現乳酸積累、酸中毒等現象。米酵菌酸引起的中毒事件在中外均有報道，2015年莫桑比克出現大規模酒類中毒事件并造成32%的當事人死亡，起因在于用于釀酒的玉米粉中含有米酵菌酸（21 ng·g-1）[5]；2018—2020年間我國中南部地區也曾多次發生因食用含有米酵菌酸的木耳或濕米粉導致的食物中毒事件[6-8]。由于米酵菌酸污染后的食品在氣味或色澤上均無明顯變化，且相較于蘑菇毒素、河豚毒素等，米酵菌酸作用的食品對象更為廣泛，在食品安全領域存在較高風險性，因此對其進行及時監控和有效防范是十分必要的[9]。本文結合最新研究報道，對米酵菌酸的前處理及檢測技術進行總結歸納，以期為后續發展高效簡便的米酵菌酸檢測方法提供思路。

1 食品中米酵菌酸的提取純化

米酵菌酸具有不飽和三羧酸結構，在溫濕度適宜的條件下可由椰毒假單胞菌酵米面亞種通過脂肪酸代謝生成[10]。研究指出，受到基質中糖類和脂肪酸組成及含量的影響，椰毒假單胞菌酵米面亞種著生于不同食品基質后的產毒量有所不同，在8種常見的食品基質中的產毒量依次為銀耳粉＞土豆粉＞玉米粉＞牛奶粉＞豆腐粉＞小米＞高粱米＞大米[11-12]。此外，不同食品基質中可能存在性質類似的雜質干擾米酵菌酸檢出，這一現象稱為基質效應[13]。LAGO等[14]提出食品基質中存在碳水化合物、色素、有機酸等化合物，以液相質譜為例，這類低分子量雜質可能與目標物同時分離流出，在電離和溶質汽化過程影響目標物的離子化效率（抑制或增強），導致低濃度樣品呈假陰性或基質復雜樣品呈假陽性。基質效應可通過空白基質液校準的方式適當消除，同時這也對目標物的提取純化工藝提出了一定要求。

當前研究普遍采用溶劑提取后固相萃取的方法提高米酵菌酸的回收率。鐘玉心等[15]發現提取劑會明顯干擾米酵菌酸在不同基質中的保留，如甲醇-氨水溶液對于米粉、玉米粉等基質中的米酵菌酸有良好的提取效果，但不適用于銀耳等高糖基質。對于大部分食品基質，可采用甲醇、乙腈等有機試劑和低比例酸性溶液復合提取，利用甲酸、乙酸等酸性化合物阻斷米酵菌酸與基質金屬離子間的絡合作用，有效抑制米酵菌酸電離，增大米酵菌酸在強極性試劑中的溶解度[16-17]。此外，溫海濱[18]提出對于多糖、蛋白質含量較高的基質（如黑木耳），直接上柱大概率會導致萃取柱堵塞，影響米酵菌酸的提取效率，因此液液萃取時可加入無水硫酸銨、硫酸鎂等使雜質沉降，降低上清液黏度。在固相萃取材料的選擇方面，李紅艷等[19]認為米酵菌酸作為一種可解離的酸性毒素，其結構上的羧基能與WAX陰離子固相萃取柱上的氨基發生離子交換，凈化后可有效富集米酵菌酸并去除玉米面中的堿性或極性物質。LIANG等[20]開發了一種Fe3O4/HNTS磁性固相萃取材料，這種材料對米粉中米酵菌酸的提取效率可達93.5%，其原理在于材料外表存在低密度羥基和電荷，在pH 4.4條件下可以選擇性與米酵菌酸的羧基結合，且在乙腈-1%甲酸溶液作用下可以完全洗脫。

有研究將QuEChERS法、液相微萃取法（Liquid Phase Micro-Extraction，LPME）等新型前處理技術應用于米酵菌酸的提取中。QuEChERS法主要分為鹽析和分散固相萃取兩部分，利用硫酸鎂、鈉鹽等提取鹽的鹽析效應使目標物從復雜基質中分離并擴散至萃取劑乙腈中，再通過多孔吸附劑和鹽進一步凈化減少雜質，具有綠色、快速、簡單的特點[21]。梁明等[22]以乙腈-水為提取液，依次將河粉基質上清液轉移至EMR-Lipid萃取柱和EMR-Polish管中離心并純化，處理后米酵菌酸的回收率高達90%以上，且沒有基質效應影響。液相微萃取法則是一種基于液液萃取的微量萃取技術，通過調節物理或化學條件，使目標物在不互溶的兩相間選擇性轉移。過程中試劑使用量少，一般以微升計[23]。黃媛等[24]探究了漂浮有機液滴凝固液相微萃取法中不同因素對米酵菌酸提取效果的影響，這種方法要求萃取劑低熔點、低密度，目標物擴散至萃取劑后，通過低溫凝固實現萃取劑與水相分離。實驗中發現冰浴條件下以30 μL十二醇和300 μL丙酮分別作為萃取劑和分散劑的效果最好，適用于銀耳、玉米粉、米粉等基質中米酵菌酸的富集。

2 食品中米酵菌酸的檢測分析

米酵菌酸作為一種低劑量致死毒素，有很高的公共安全危害性。但鑒于米酵菌酸無色無味，日常無法通過感官直接判斷其是否存在于食品中，需要輔以實驗分析技術辨別[25]。近年來，有關食品中米酵菌酸的檢測方法發展迅速，早前使用的薄層色譜法、分光光度法等因流程復雜、靈敏度差、特異性不明顯等缺點已逐漸被淘汰，并建立了以液相色譜、質譜聯用等儀器為基礎的檢測方法或快檢技術[26]。

2.1 高效液相色譜法

《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》（GB 5009.189—2016）將液相色譜法作為銀耳或米面制品中米酵菌酸的檢測方法，但該標準適用范圍較小，且前處理流程復雜，試劑消耗量大。有報道參照標準，以優化上機工藝或擴大液相色譜在米酵菌酸檢測中的應用為方向進行研究。康翠欣等[27]提出流動相pH對米酵菌酸在色譜柱中的保留效果影響較大，用酸性流動相可以抑制米酵菌酸離子化，增加其在色譜柱中的保留，并減少米酵菌酸結構上的羧基與固定相中殘存硅醇基結合，改善色譜峰峰形，但甲酸和乙酸體系的差異不大；該研究同時提出，相較于乙腈，以高比例甲醇作為流動相有利于出峰時間提前，目標物與雜質分離效果也較好。周霞等[28]以1%乙酸水和甲醇為流動相，在二極管陣列檢測器267 nm波長下檢測米酵菌酸，該方法檢出限為0.0025 mg·kg-1，在玉米面、米粉等基質中均有較高響應。俞穗珍[29]在267 nm波長下檢測銀耳中的米酵菌酸，并提出10～30 μL范圍內提高進樣量，會導致目標物峰形不佳，拖尾現象明顯。陳嘉聰等[30]公開了一種二極管陣列檢測器-液相色譜方法，以甲醇和甲酸水為流動相進行梯度洗脫，在258 nm波長下檢測，結果表明該方法在0.5～25 μg·mL-1濃度內線性良好，可廣泛應用于谷類、薯類、濕米粉類等大部分可能含有米酵菌酸的食品。但就實驗操作和結果精確度方面而言，高效液相色譜法仍存在分析時間長、檢出限高、取樣量大等局限性。

2.2 超高效液相質譜法

相較于液相色譜法，超高效液相質譜法針對米酵菌酸檢測的靈敏度更高，定性定量更準確，適用于大批量樣品的檢測。張偉等[31]發現米酵菌酸分子上帶有羧基，在離子源處易電離成帶負電離子，因此選用負離子模式檢測米酵菌酸響應更好；該研究以乙腈和乙酸銨溶液為流動相梯度洗脫，在酵米面基質中米酵菌酸的回收率可達88%以上。張潔等[32]建立了一種快速測定木耳中米酵菌酸的質譜方法，并對流動相、質譜參數等測試條件進行優化，優化后采用負離子模式檢測，并以母離子m/z485.4進行子離子全波長掃描，檢出限低且目標物分離度好。FALCONER等[33]將液相質譜法用于發酵飲料中米酵菌酸的測定，采用負離子和多反應監測模式；實驗中發現該方法可同時進行異米酵菌酸（米酵菌酸的同分異構體，光照或堿性條件下轉化生成）的定性定量。覃冬杰等[34]以螺螄粉為檢測對象，對比了不同流動相組合對質譜檢測效果的影響，發現甲酸在負離子模式下可能會抑制米酵菌酸電離進而影響目標物峰形，以乙腈和含0.1%甲酸的甲酸銨為流動相時峰形最好且響應偏高。

2.3 快速檢測法

快速檢測法是基于目標物與特定物質結合發生熒光或免疫等反應的分析方法，常見如膠體金法、熒光層析法、酶聯免疫吸附法等[35]。相較于大型儀器檢測，快速檢測法具有操作簡便、快速定性、對儀器依賴性低的特點，適用于現場抽查、大批量樣品快篩等檢測工作。張小波等[36]開發了一種根據顯色強度判定米酵菌酸含量的熒光定量檢測卡，在1～100 ng·mL-1濃度內線性良好，可有效實現米面、銀耳等食品中米酵菌酸的快速定量。呂曉靜等[37]根據米酵菌酸分子與載體蛋白偶聯形成抗原，可與特異性抗體結合的免疫原理，公開了一種由抗原-抗體分子對應吸光度定量的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒對米酵菌酸的檢測靈敏度低至10 μg·L-1，可針對性檢測發酵玉米制品、銀耳等食品。萬宇平等[38]發明了一種基于米酵菌酸分子與載體蛋白偶聯，結合抗體后可與抗原偶聯蛋白競爭顯色的膠體金試紙條，對銀耳、酵米面等食品中米酵菌酸的定量低限為5 μg·kg-1，且假陽性率低。ZHANG等[39]將半胱胺改性金納米粒子作為比色探針，在樣品陽性條件下可以誘導粒子聚集顯色，并通過手機應用程序測定基質液顯色值，在0.10～1.44 μmol·L-1濃度可準確量化基質中米酵菌酸的濃度。

3 結語

米酵菌酸分布的食品基質范圍較廣且難以依靠常規方法將其去除，存在較高的食用風險，這對米酵菌酸的檢測工作提出了嚴格要求。目前米酵菌酸的檢測工作主要參照《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》（GB 5009.189—2016）進行，但該方法前處理流程長，不適用于大批量樣品的篩查。因此，有必要建立更為簡便高效的檢測方法。近年來，已有大量研究在米酵菌酸的提取純化和檢測分析技術領域進行有益探索，以期在降低基質效應、提高米酵菌酸上機純度的基礎上縮短實驗流程，提高分析定量的準確度，這為開發高精密度、高分析通量的檢測方法開辟了新思路。