IL-35表達對小鼠脾臟CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群分化的影響*

張志強,楊魯寧,劉 恒,王朝霞,張曉寧△

[1.天津市南開醫院病理科 300100;2.中國人民武裝警察部隊山東總隊泰安支隊衛生隊,山東泰安 271000;3.山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)臨床與基礎醫學院(基礎醫學研究所),濟南 250000]

調節性T淋巴細胞(regulatory T cells,Tregs)是一類特殊的T淋巴細胞群,能夠有效抑制T淋巴細胞對自體或異體抗原的免疫反應,是治療自身免疫性疾病和器官移植免疫排斥反應的首選[1-5],其中CD4+叉頭/翅膀狀螺旋轉錄因子3+Tregs(CD4+Foxp3+Tregs)的研究和應用最為廣泛[6]。研究表明,CD4+Foxp3+Tregs的免疫抑制作用可依賴于白細胞介素(interleukin,IL)-35的參與[7-8]。IL-35是繼轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β、和IL-10之后發現的抑制性細胞因子,由兩個亞基組成[α鏈IL-12A/p35和β鏈EB病毒誘導基因3(Ebi3)],與IL-12、IL-23、IL-27共同構成了IL-12細胞因子家族[9-10],最早發現由天然Tregs分泌,能夠促進Tregs的體外增殖[7,11]。本研究將構建小鼠IL-35基因表達質粒,通過尾靜脈注射到小鼠體內,探討IL-35表達對小鼠脾臟中CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群分化的影響,為IL-35基因應用于體內免疫治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

健康雄性無特殊病原體(SPF)級C57BL/6J小鼠(8～12周齡)9只,體重18～22 g,購自北京軍事醫學科學院實驗動物中心,飼養于天津醫科大學SPF級實驗動物中心,小動物護理及實驗方案經天津醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2實驗試劑

基因表達載體為鼠干細胞病毒載體(pMSCV-GFP),小鼠IL-35基因來自質粒pcDNA3.1-IL-35,均由天津醫科大學劉義老師惠贈。1×磷酸鹽緩沖液(PBS)、紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司,TRIzol購自美國Invitrogen公司,逆轉錄試劑HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司。流式標記熒光抗體:異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗小鼠CD4抗體、FITC標記的抗小鼠CD4抗體、藻紅蛋白(PE)標記的抗小鼠CD8抗體、PE標記的抗小鼠CD25抗體購自美國eBioscience公司。qPCR檢測所用的引物、內參基因3-磷酸甘油醛脫氰酶(GAPDH)引物(貨號:B661304)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1小鼠IL-35基因表達載體(pMSCV-IL-35-GFP)的構建

采用PCR法擴增獲得小鼠IL-35基因全長片段,將該片段連入pMSCV-GFP多克隆位點區,獲得攜帶IL-35基因的質粒載體pMSCV-IL-35-GFP,測序驗證重組載體無堿基突變。

1.2.2pMSCV-IL-35-GFP質粒注射

將9只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為3組:PBS組、pMSCV組和pMSCV-IL-35組,每組3只,3組小鼠的體重及活躍狀態沒有明顯區別。分別向3組小鼠尾靜脈注射PBS、pMSCV-GFP空載質粒和pMSCV-IL-35-GFP質粒。72 h后分離每只小鼠脾臟。

1.2.3小鼠脾臟Ebi3、IL-12a mRNA相對表達水平的檢測

采用TRIzol法抽提每只小鼠脾臟總RNA,超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度,RNA濃度>200 ng/μL,260、280 nm處吸光度值比值(A260/A280)為1.8～2.2,說明提取的總RNA質量合格。采用實時熒光定量逆轉錄PCR(reverse transcription-quantitative real-time PCR,RT-qPCR)檢測小鼠脾臟Ebi3和IL-12a mRNA相對表達水平,GAPDH為基因表達內參,每個樣品設3次重復。檢測Ebi3、IL-12a mRNA所用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4流式細胞術檢測小鼠脾臟CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群

摘取每只小鼠的脾臟并剪碎,在200目細胞篩上研磨得到細胞懸液,用紅細胞裂解液處理,PBS洗滌后離心獲得淋巴細胞。按每管2×105個細胞分成4組:第1組加入FITC標記的抗小鼠CD4抗體;第2組加入PE標記的抗小鼠CD8抗體;第3組加入FITC標記的抗小鼠CD4抗體和PE標記的抗小鼠CD25抗體,4 ℃避光孵育30 min,用PBS清洗1次,用流式細胞儀進行檢測;第4組未標記抗體的細胞作為對照。

1.2.5小鼠脾臟顆粒酶B(Gzmb)、Foxp3 mRNA相對表達水平的檢測

為進一步驗證流式細胞術所檢測的CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群分化情況,采用RT-qPCR檢測CD8+T淋巴細胞免疫功能分子Gzmb[12]及Treg細胞特異轉錄因子Foxp3[6]mRNA相對表達水平,GAPDH為基因表達內參,每個樣品設3次重復。檢測Gzmb、Foxp3 mRNA所用的引物序列見表1。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 小鼠脾臟Ebi3和IL-12a基因的表達水平

與PBS組或pMSCV組比較,pMSCV-IL-35組小鼠脾臟Ebi3和IL-12a mRNA相對表達水平明顯升高(P<0.001),見表2。

表2 3組小鼠脾臟Ebi3和IL-12a mRNA相對表達水平比較

2.2 IL-35表達對脾臟T淋巴細胞分型的影響

與PBS組或pMSCV組比較,pMSCV-IL-35組小鼠脾臟CD8+T淋巴細胞百分比明顯降低(P<0.001),CD4+CD25+Tregs百分比則明顯升高(P<0.001),見圖1～3、表3。

圖2 流式細胞術檢測脾臟總CD8+T淋巴細胞的百分比

圖3 流式細胞術檢測脾臟CD4+CD25+Tregs百分比

表3 3組小鼠脾臟細胞分化百分比比較

2.3 IL-35表達對脾臟CD8+T淋巴細胞Gzmb基因和CD4+CD25+Tregs Foxp3基因表達的影響

進一步驗證CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群分化情況,結果顯示:與PBS組或pMSCV組比較,pMSCV-IL-35組Gzmb mRNA表達水平明顯降低(P<0.01),而Foxp3 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01),見表4。

表4 3組小鼠脾臟Gzmb和Foxp3 mRNA相對表達水平比較

3 討 論

IL-12家族有4個成員:IL-12、IL-23、IL-27和IL-35[13-14]。這4個成員有著相似的配體和結構特征,但是與其他3個成員不同的是,IL-35具有獨特的免疫調節功能[15-16]。IL-12、IL-23和IL-27主要由巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞等抗原提呈細胞(antigen presenting cells,APCs)在被病原體特異性模式識別激活后產生[17]。IL-35是IL-12細胞因子家族的新成員,是由α鏈p35和β鏈Ebi3組成的異源二聚體,主要由CD4+Foxp3+Tregs合成并分泌[10]。Ebi3是Foxp3的下游靶點,COLLISON等[11]研究報道,將Tregs與效應性T淋巴細胞(Teffs)共培養時,Ebi3和IL-12a mRNA水平明顯上調,表明后者可能是免疫調節過程的積極參與者,并促進了IL-35的產生,這也解釋了Tregs表達IL-35的原因。反過來,IL-35的存在也會誘導T淋巴細胞向Tregs分化[18]。這種特殊的免疫調節作用使得IL-35被廣泛應用于各種免疫性疾病與器官移植免疫排斥反應的治療中[19-20]。作者前期分別利用大腸桿菌為腸道固有菌株及尾靜脈注射的間充質干細胞易于在肺部滯留的特性,通過灌胃IL-35修飾的大腸桿菌治療葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的小鼠潰瘍性結腸炎,另通過尾靜脈注射IL-35修飾的間充質干細胞治療脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導的小鼠急性肺損傷,探討IL-35表達在上述兩種炎癥模型中的應用。結果發現,IL-35的表達可減輕兩種疾病小鼠體內炎性損傷及炎性細胞的浸潤,促進Tregs增殖分泌,減少輔助性T淋巴細胞17(Th17)的數量[21-22],為炎癥相關疾病的治療提供了新的思路和方法。但現有的結果主要來自疾病模型,在沒有抗原刺激的情況下IL-35是否會影響T淋巴細胞亞群的分化尚不明確,因此本研究對此進行探索。

本研究將一種可以在體內表達IL-35的載體(Ebi3和IL-12a融合基因表達載體)通過尾靜脈注射到小鼠體內,觀察IL-35表達對T淋巴細胞亞群分化的影響。72 h后取小鼠脾臟,RT-qPCR檢測IL-35兩個亞基Ebi3和IL-12a mRNA的表達水平。結果顯示,pMSCV-IL-35組的小鼠脾臟Ebi3和IL-12a mRNA表達水平較PBS組、pMSCV組明顯升高,說明在接受pMSCV-IL-35-GFP質粒的小鼠中可觀察到Ebi3和IL-12p35的高表達。進一步通過流式細胞術檢測表達的IL-35對小鼠脾臟T淋巴細胞(包括總CD4+、CD8+T淋巴細胞和CD4+CD25+Tregs)分型的影響,結果顯示,與PBS組、pMSCV組相比,pMSCV-IL-35組小鼠CD4+T淋巴細胞百分比無明顯變化,CD8+T淋巴細胞百分比明顯降低,而CD4+CD25+Tregs百分比明顯升高;另外,CD8+T淋巴細胞免疫功能分子Gzmb mRNA相對表達水平明顯降低,而Tregs特異性轉錄因子Foxp3 mRNA相對表達水平明顯升高。這說明表達產生的IL-35可以影響T淋巴細胞分化,一方面可抑制殺傷性T淋巴細胞的活性,另一方面可誘導Tregs產生。殺傷性T淋巴細胞是以CD8+分子為主要標記的一類Teffs,具有細胞毒活性[23-24];而Tregs則是以CD4+CD25+Foxp3+為主要特征且被研究者普遍認為具有免疫抑制特性的細胞亞群[6,25-26],提示IL-35對Teffs具有免疫抑制作用,而它的存在促進T淋巴細胞向Tregs方向分化[11]。IL-35的免疫抑制能力已經在部分疾病模型中得到了說明[27-30],這里列出的基于正常健康小鼠的數據可以在一定程度上幫助理解IL-35對正常機體的影響及潛在的疾病防治機制,并為IL-35基因應用于體內免疫治療提供理論依據。但是,本研究是在正常動物中進行的,結果可能與病理條件下有所不同,如與PBS組相比,pMSCV組小鼠體內CD4+CD25+Tregs百分比一定程度增加,可能是由于外源性pMSCV質粒使小鼠產生了一定程度的免疫應激現象,并進一步激活了機體自身對免疫應答的調節功能,誘導了Tregs的分化。

綜上所述,IL-35作為IL-12家族中發揮免疫抑制作用的細胞因子,其從正常及疾病狀態下對免疫系統的調節潛能為炎癥性疾病和免疫性疾病的治療奠定了理論基礎。但IL-35的受體及相應下游信號通路也暫未完全闡明,目前相關臨床和基礎研究的數據也十分有限,有待深入探究。