貴州魔芋軟腐病菌多基因分子鑒定及其致病力分析

黃露　周兵正　安星宇等

關鍵詞 魔芋；軟腐病；病原鑒定；致病力

中圖分類號：S 436.32 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022328

魔芋Amorph，ophallus konjac是天南星科的一種多年生草本植物，主要分布在中國、日本及東南亞等國家和地區，其塊莖富含葡甘聚糖，被廣泛用于食品、醫藥等領域，是一種重要的經濟作物，也是貴州省的特色產業之一[1-2]。隨著魔芋大面積規模化種植，病害發生也越來越重，其中魔芋軟腐病是魔芋生產中危害最嚴重的病害，可造成產量損失30%～50%，甚至絕收[3]。魔芋軟腐病普遍發生于貴州魔芋種植區，已成為限制貴州魔芋產業發展的主要因素之一。

魔芋軟腐病是由果膠桿菌Pectobacterium和迪基氏菌Dickeya等引起的細菌性病害，有學者認為其致病菌為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種Erwinia carotovora subsp.carotovora[4-5]，修建華等通過16S- 23S rDNA轉錄間隔區分析，將魔芋軟腐病菌分為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種、菊歐文氏菌Erwinia chrysanthemi及一株未能確定的菌株[6]。吳金平認為我國魔芋軟腐病的病原菌主要為胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種和菊歐文氏菌，同時分離到一株新的引起軟腐病的細菌一腸桿菌屬細菌En-terobacter sp.[7]。盧美歡等發現陜南地區魔芋軟腐病的病原菌為胡蘿卜果膠桿菌Pectobacterium ca-rotovorum[8]。孫苗苗研究發現引起湖北省魔芋軟腐病的主要為海芋果膠桿菌Pectobacteriumaroidearum和方中達迪基氏菌Dickeya fang-zhongdai[9]。魏環宇等發現云南省珠芽魔芋軟腐病的病原菌為海芋果膠桿菌[10-11]。而對貴州魔芋軟腐病菌的研究，僅有本研究組前期發現黔東南魔芋軟腐病菌為菊歐文氏菌E.chrysanthe-mi[12]。目前貴州省內許多地區引起軟腐病的病原菌種類和分布仍不清晰，本研究采集貴州省主要魔芋種植基地的軟腐病樣，進行病菌的分離鑒定及致病力分析，明確貴州魔芋軟腐病菌種類、致病力及分布特點，旨在為魔芋軟腐病的防治工作提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料和培養基

從貴州省威寧、水城、赫章、雷山等魔芋種植地采集發生軟腐病的魔芋塊莖、葉柄，裝進采樣袋中，標記采集信息，帶回試驗室備用。

營養瓊脂培養基（NA）：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉5g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂12g/L。營養肉湯培養基（NB）：蛋白胨10g/L，牛肉膏粉3g/L，氯化鈉5g/L。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌分離

采用平板劃線法分離病原菌[13-14]。病樣用75%乙醇表面消毒2 min，在無菌條件下挑取魔芋病樣病健交界部分的小塊組織，轉移到含0.5 mL無菌生理鹽水（0.85%NaCl）的無菌培養皿中，用滅菌玻璃棒將病組織搗碎，無菌條件下室溫靜置10～15 min，形成細菌懸浮液。用滅菌的移植環蘸取少量汁液在NA平板上劃線，于28℃恒溫培養箱中培養24h，挑取單菌落，轉接純化1～2次后，4℃和—80℃保存。

1.2.2病原菌的分子鑒定

1.2.2.1病原菌DNA提取及PCR擴增

采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌基因組DNA，參考Bing等和Waleron等的方法[15-16]，選用icdA、mdh、mtlD、proA、rpoS基因的引物（表1）進行PCR擴增。PCR擴增體系（25μL）：2×Taq PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH20 9.5μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30s，退火溫度下退火30s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸5min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將有清晰條帶的樣品送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.2.2單基因和多基因序列分析及系統發育樹構建

將測序獲得的序列進行BLAST比對。采用BioEdit軟件對從NCBI數據庫中獲取的可信度較高的相似序列進行多序列比對，基于icdA，mdh，mtlD，proA和rpoS 5個管家基因單個基因及多基因，用MEGA 6.0軟件鄰接法進行系統發育樹構建和聚類分析。

1.2.3病原菌的致病力測定

分離的病原菌于NB培養液中，28℃，180 r／min培養24 h，配制成濃度1×10 cfu/mL的菌懸液，吸取2μL接種于用75%乙醇消毒的健康魔芋塊莖（40 mm×40 mm）中央處，以無菌水為對照，2次重復，放于28℃培養箱中，培養24 h后觀察發病情況，根據病斑的長度評價病菌的致病力，用Excel和DPS 7.5軟件對數據進行統計分析，采用Duncan氏新復極差法（α=0.05）進行差異顯著性分析。分級標準：病斑長度>30 mm為高致病（highly pathogenic level，H）；10mm<病斑長度≤30 mm為中等致病力（moderately pathogenic level，M）；病斑長度≤10 mm為低致病力（lowly pathogenic level，L），

2結果與分析

2.1魔芋軟腐病原菌分離

通過對貴州赫章、威寧、雷山、平壩、息烽、花溪、荔波、關嶺、水城等魔芋種植地的軟腐病進行調查，發現植株于展葉期染病，葉柄頂部及基部首先出現濕潤狀暗綠色或黑色小斑（圖1a），后整個葉柄潰爛，植株倒伏，散發惡臭味；植株基部或塊莖染病時，早期葉片仍保持綠色，后整株逐漸變黃、干枯、倒伏，地下塊莖呈灰色或黑灰色腐爛，并散發惡臭味（圖1b～c）。對采集的各魔芋軟腐病樣進行病原菌分離、純化，共獲得47株菌株，回接魔芋塊莖后都造成塊莖腐爛，但不同菌株對魔芋塊莖的致病程度不同（圖1d～f）。

2.2單基因序列分析

以分離的魔芋軟腐病菌基因組總DNA為模板，分別進行icdA、mdh、mtlD、proA、rpoS等5個管家基因的PCR擴增及測序，并分別構建單基因系統發育樹，發現不同基因構建的系統發育樹對軟腐病菌的鑒定結果有一定的差異，但所有菌株經鑒定均分屬于為海芋果膠桿菌Pectobacterium aroidea-rum、胡蘿卜果膠桿菌Pectobacterium carotovoorum或方中達迪基氏菌Dickeya fangzhongdai 3個種，其中根據mdh，mtlD，proA基因構建系統發育樹結果基本一致，而采用icdA和rpoS基因時，菌株GZCC.20047、GZCC.20049和GZCC.20053鑒定結果有差異。基于icdA基因，GZCC.20049菌株與P.carotovorum聚為一支，GZCC.20053單獨聚為一支；基于rpoS基因，菌株GZCC. 20047、GZCC.20053與P.aroidearum聚為一支（圖2）。

2.3多位點序列分析

將分離的魔芋軟腐病菌基因組的5個管家基因片段進行拼接、比對分析并構建多基因聯合序列系統發育樹（圖3）。發現47個菌株有的聚在同個類群，有的則聚在不同類群，其中GZCC.20001、GZCC. 20003、GZCC. 20004等33個菌株與Pectobacterium aroidearum聚在同一個分支，同源性較高，均屬于P.aroidearum；GZCC.20039菌株與Pectobacterium carotovorum聚類在同一個分支，屬于P.carotovorum；而GZCC. 20002、GZCC. 20010、GZCC. 20011等13個菌株與Dickeya fangzhongdai聚類在同一個分支，為D.fangzhongdai。

2.4魔芋軟腐病菌致病力測定

通過對魔芋軟腐病菌進行致病力測定，發現不同軟腐菌株的致病力有一定的差異。其中菌株GZCC. 20022、23、24、25、26、43、47、48、49和52號菌株具有強致病力，病斑直徑達40 mm；GZCC. 20003、4、5、7、8、12號菌株致病力較弱，病斑直徑在5. 7～9.8 mm；其余菌株的致病稍弱，病斑在10.5～28.5 mm間（表2）。

2.5貴州魔芋軟腐病菌分布情況

通過對貴州魔芋軟腐病病原菌進行鑒定，發現病菌分為3個種Pectobacterium aroidearum、P.ca-rotovorum和Dickeya fangzhongdai，其中P.aroidearum為貴州魔芋軟腐病主要病原菌，約占分離菌株數的70%，廣泛分布在多個地區；其次為D.fangzhongdai，占28%，也普遍存在于貴州魔芋種植區；P.carotovorum僅在息烽縣魔芋種植地分離到1株，占2%。

3結論與討論

隨著分子生物技術的發展，近20年來，軟腐病菌的分類發生很大的變化。1998年，歐文氏菌屬Erwinia spp.有了重大修訂，其許多種被歸到果膠桿菌屬Pectobacterium[17-18]，隨后在2005年Pecto-bacterium chrysanthemi被劃定到新屬迪基氏菌屬Dicke ya[19-20]中。目前Pectobacterium屬包括19個種，分別為獼猴桃果膠桿菌P.actinidiae，水生果膠桿菌P.aquaticum，海芋果膠桿菌P.aroidearum，黑莖果膠桿菌P.atrosepticum，甜菜果膠桿菌P.betavasculorum，巴西果膠桿菌P.brasiliense，仙人掌果膠桿菌P.cacticidum，胡蘿卜果膠桿菌P.ca-rotovorum，泉水果膠桿菌P.fontis，氣味果膠桿菌P.oderiferum，帕蒙蒂埃果膠桿菌P.parmentieri，微小果膠桿菌P.parvum，秘魯果膠桿菌P.peruvi-ense，北極星果膠桿菌P.polare，波蘭果膠桿菌P.polonicum，旁遮普果膠桿菌P.punjabense，廣泛果膠桿菌P.versatile，山葵果膠桿菌P.wasabiae和馬蹄蓮果膠桿菌P.zantedeschiae；而Dickeya屬有12個種，分別為菊迪基氏菌D. chrysanthemi，達旦迪基氏菌D.dadantii（subsp.dadantii and subsp.dieffenbachiae），石竹迪基氏菌D.dianthicola，玉米迪基氏菌D.zeae，水稻迪基氏菌D.oryzae，玉米迪基氏菌D.parazeae，茄迪基氏菌D.solani，方中達迪基氏菌D.fangzhongdai，水生迪基氏菌D.aquatica，湖泊迪基氏菌D.lacustris，水棲迪基氏菌D.undicola和喜禾本迪基氏菌D.poaceiphilan[18]。

本研究通過建立單基因和多基因系統發育樹對貴州魔芋軟腐病病原菌進行鑒定，發現貴州魔芋軟腐病病原菌具有一定的多樣性，包括海芋果膠桿菌P.aroidearum、胡蘿卜果膠桿菌P.carotovorum和方中達迪基氏菌D.fangzhongdai 3個種，但一些菌株的單基因鑒定結果與多基因聯合鑒定結果有一定差異，由于P.aroidearum、P.carotovorum和D.fangzhongdai 3個種比較相似，在歷史分類地位上也常把其歸為一類[17-19，21]。僅通過單個基因對其進行分類鑒定有一定的局限性，而采用多基因和全基因測序對其鑒定的準確性更好。本研究發現P.aroidearum為魔芋軟腐病菌的主要種，廣泛分布于貴州多個魔芋種植區，其菌株間致病力差異較大，低、中、高致病力菌株都有，而D.fangzhongdai菌株間差異較小，僅有中、高致病力菌株。

海芋果膠桿菌P.aroidearum在2013年被認定主要危害單子葉植物，但不僅限于單子葉植物的軟腐病菌新種[22]，近年來相繼被報道危害馬鈴薯、西葫蘆、白菜、魔芋、萵苣、辣椒、馬蹄蓮、胡蘿卜、合果芋、甘蔗等作物[18，21，23-32]。對于魔芋軟腐病的病原菌，以前報道多是胡蘿卜歐文氏菌胡蘿卜亞種Pecto-bacterium carotovora subsp.carotovora（P.carotovo-rum）和菊歐文氏菌Erwinia chrysanthemi （Dickeya sp.），但近年來通過全基因組及多基因序列分析，發現一些P.carotovorum其實是P.aroidearum，例如從陜西魔芋軟腐樣品中分離到一株細菌M8為P.aroidearum[21，33]，魏環宇等發現云南省珠芽魔芋軟腐病的致病菌也為P.aroidearum[10-11]。

本研究基于貴州魔芋軟腐病菌種類不清的情況，確定了貴州魔芋軟腐病菌的主要種類、致病力及分布情況，明確P.aroidearum、D.fangzhongdai是貴州魔芋軟腐病的主要病菌，為魔芋軟腐病的發生流行和科學防控提供了科學依據。