一株拮抗4種馬鈴薯病原真菌的擬康寧木霉的分離鑒定

魏琪　郭梅　邵紅濤等

關(guān)鍵詞 擬康寧木霉；馬鈴薯；病原真菌；拮抗作用

中圖分類號：S 435.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022201

木霉Trichoderma spp.是一類在許多生態(tài)系統(tǒng)中均有發(fā)現(xiàn)的真菌，主要分布于土壤或植物根部[1]。木霉因其高拮抗能力和真菌寄生潛力，對植物病原菌具有廣譜的抑制作用，同時，對植物還有促生作用[2]。擬康寧木霉T.koningiopsis分布較廣，為全球性分布的種類，在中國于2010被首次報道[3]。目前，我國報道的具備高效抑菌作用的擬康寧木霉菌株尚少，因此發(fā)掘不同生境下的菌株用于生物防治研究具有重大意義。

馬鈴薯Solanum tuberosum是僅次于小麥、水稻和玉米的世界第四大重要糧食作物，在保障糧食安全方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。其作為主要糧食、蔬菜和加工原料作物，在我國種植廣泛。馬鈴薯種植過程中常常遭受病害的困擾，尤其是長期連作種植導(dǎo)致病蟲害大量聚集和流行，其中以真菌危害（包括晚疫病、早疫病、絲核菌AG3和AG5引起的莖潰瘍病、黑痣病、接骨木鐮孢引起的塊莖干腐病等）為主，不僅限制了馬鈴薯增產(chǎn)的潛能，同時也增加了馬鈴薯儲藏的損失。

本研究從黑龍江省的土壤中分離獲得一株木霉，采用薯塊活體抑菌試驗和對峙試驗測定其對馬鈴薯4種病原菌的抑制作用，并通過生物學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定其種類，為其在馬鈴薯多種病害生物防治中的應(yīng)用工作奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌株及培養(yǎng)條件

2015年8月8日，于黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)玉米田采集土壤樣品，通過選擇性培養(yǎng)基分離木霉菌株。供試病原真菌包括融合群分別為AG3和AG5的2株立枯絲核菌Rhizoctonia solani（編號為AG3和AG5）；1株接骨木鐮孢Fusarium sambuci-num，1株馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani，上述病原真菌由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物所病蟲害研究室分離保存。

用于分離鑒定的選擇性培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基（蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，瓊脂粉20 g，1/3000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水900 rnL）；菌株純化及對峙培養(yǎng)等使用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯提取物12 g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉14g/L，pH 6.0）。

木霉、絲核菌、鐮孢菌的培養(yǎng)溫度為25℃，早疫病菌的培養(yǎng)溫度為23℃。

1.2菌株的分離純化

稱取10 g土壤樣品，加入90 mL無菌水，室溫下150r／min振蕩培養(yǎng)30 min。吸取上清液采用10倍梯度稀釋法分離木霉，每個選擇性培養(yǎng)基平板上均勻涂布100μL土壤稀釋液。而后，在10稀釋液平板上挑取單菌落在PDA培養(yǎng)基上進行純化，將獲得的菌株命名為TC24。

1.3分子生物學(xué)方法鑒定木霉TC24的種類

使用天根公司的植物DNA提取試劑盒提取木霉基因組。以木霉TC24的DNA為模板，利用ITS通用引物ITS1／ITS4（ITSl： 5'-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG3′; ITS4： 5′-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3′）[5]進行PCR擴增。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性45s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。對PCR產(chǎn)物測序并在NCBI網(wǎng)站（www. ncbi. nlm nih.gov）上進行BLAST比對。應(yīng)用MEGA X軟件與NCBI公布的擬康寧木霉及其他相關(guān)菌株的基因序列，利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4活體測定木霉TC24對病原真菌的抑制作用

采用曲遠(yuǎn)航等的方法[6]并作改良后，在活體上測定木霉TC24對4種病原真菌的抑制作用。用切塊器將馬鈴薯塊莖切成20mm×20mm×10mm的均勻薯塊，去離子水浸泡并沖洗掉表面的淀粉，1%NaClO表面滅菌5min，用無菌去離子水沖洗3次。木霉孢子懸浮液浸泡薯塊30 min，取出后在超凈工作臺上晾干。滅菌密封盒內(nèi)放置無菌濾紙，將晾干的薯塊置于濾紙上。每個薯塊中心滴加1種病原真菌的孢子懸浮液10μL，每種病原真菌3次重復(fù)。以無菌去離子水浸泡的薯塊不接種病原菌為水對照；以木霉孢子懸浮液浸泡的薯塊不接種病原菌為陰性對照；以無菌去離子水浸泡的薯塊滴加病原真菌孢子懸浮液為病原菌對照。將密封盒放置于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃暗培養(yǎng)7d。采用Excel 2016處理數(shù)據(jù)，SPSS 22.0軟件的t測驗分析病原菌對照組與TC24處理組發(fā)病級別的差異顯著性。

按照以下標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計發(fā)病級別：0級，未見明顯病斑；1級，病斑面積≤25%；2級，25%<病斑面積≤50%；3級，50%<病斑面積≤75%；4級，病斑面積>75%。

1.5木霉與病原真菌的對峙培養(yǎng)

根據(jù)Halifu等的平皿對峙培養(yǎng)[7]法測定木霉TC24對4株供試病原真菌的抑制作用。用打孔器分別打取木霉和病原真菌的菌餅（直徑為6mm）用于對峙培養(yǎng)。處理組：1個木霉菌餅與1個病原真菌菌餅對峙接種于PDA平板（直徑為90 mm）上，二者之間的距離為40 mm。對照組：只接種病原真菌。接種菌除早疫病菌在23℃下培養(yǎng)外，其余病原真菌在25℃下培養(yǎng)。拮抗試驗重復(fù)3次，每次處理組和對照組各接種3個平板。

待對照組病原真菌長滿整個培養(yǎng)皿時，分別測量對照平板上靶標(biāo)菌菌落直徑（Φ）和對峙培養(yǎng)平板上靶標(biāo)菌菌落直徑（Φ），計算抑制率并調(diào)查覆蓋度級別。抑制率的計算公式[5]為：抑制率=（Φ—Φ）/Φ×100%。

以覆蓋度表示木霉菌株對靶標(biāo)菌的寄生能力，覆蓋度的分級標(biāo)準(zhǔn)參照陳書華等[8]，設(shè)為3級。Ⅰ級：木霉菌落與病原菌菌落不接觸，木霉菌絲不能覆蓋病原菌菌落；Ⅱ級：木霉菌絲覆蓋病原菌菌落1／2以下，病原菌菌落健康，顏色無變化；Ⅲ級：木霉菌絲全部覆蓋病原菌菌落，并在病原菌菌落上大量產(chǎn)孢，病原菌菌落萎縮，顏色變暗。

1.6木霉抑制立枯絲核菌的電子顯微鏡觀察

切取木霉TC24和立枯絲核菌交叉位置的菌絲，浸入固定液4%戊二醛中固定4h，緩沖液清洗后，四氧化二鋨固定2～4h，雙蒸水清洗后乙醇梯度脫水，叔丁醇干燥后離子濺射，用德國蔡司公司SIGMA300熱場發(fā)射掃描電鏡觀察記錄菌絲形態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1木霉TC24的形態(tài)觀察

PDA培養(yǎng)基上，25℃時TC24氣生菌絲生長迅速且茂盛，培養(yǎng)72 h菌落可長滿9cm培養(yǎng)皿。菌絲初為白色，后有綠色分生孢子產(chǎn)生，菌落無明顯的環(huán)紋出現(xiàn)（圖1a）。分生孢子梗直立，分生孢子梗直接產(chǎn)生瓶梗或產(chǎn)生二級分支，二級分支傾向于對生（圖lb）。分生孢子單孢，橢圓形，壁光滑（圖lc）。TC24的形態(tài)特征與李廣記等[3]和羅梅等[9]對擬康寧木霉的形態(tài)描述一致。

2.2木霉TC24種的鑒定結(jié)果

以TC24的DNA為模板，利用ITS通用引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體后進行測序，獲得大小為606bp的片段（GenBank登錄號為M2669206）。經(jīng)過BLAST后，ITS片段與Trichoder-ma koningiopsis菌株Tk1（MT111912.1）的序列相似度達(dá)到99%。應(yīng)用MEGA X軟件與NCBI公布的T.koningiopsis菌株的基因序列，利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，TC24與T.konzngz-opsis的菌株同為一個分支（圖2）。結(jié)合形態(tài)特征及ITS序列分析結(jié)果，菌株TC24為擬康寧木霉T.koningiopsis。

2.3木霉TC24對侵染馬鈴薯的幾種真菌的活體抑制作用

經(jīng)木霉TC24孢子懸浮液浸泡的薯塊接種病原真菌的孢子懸浮液后，與相應(yīng)的只接種病原真菌的陽性對照薯塊相比，發(fā)病級別均有所降低（表1）。其中，接種早疫病菌、AG3型立枯絲核菌和AG5型立枯絲核菌時，陽性對照發(fā)病級別為1.0～L2級，而TC24處理后的薯塊發(fā)病為0級（圖3a～c，表1）；接骨木鐮孢的對照組發(fā)病級別為1.8～2.0級，但經(jīng)過TC24孢子懸浮液處理后發(fā)病級別降為0.8～L0級（圖3d，表1）。差異顯著性分析結(jié)果表明：經(jīng)過木霉TC24處理的塊莖上病原菌發(fā)病程度極顯著低于只接病原菌的對照組（表1）。以上活體試驗的結(jié)果表明，木霉TC24能夠降低4種馬鈴薯病原真菌病害的發(fā)病程度。

同時，經(jīng)過木霉TC24孢子懸浮液浸泡后的薯塊與水對照表現(xiàn)一致（圖3e），即木霉TC24可以在馬鈴薯上安全使用。

2.4對峙培養(yǎng)中擬康寧木霉TC24對病原真菌的抑制作用

通過測量和統(tǒng)計對峙培養(yǎng)中每種病原菌菌落的直徑，獲得木霉TC24對每種病原真菌的平均抑菌率和平均覆蓋度級別（表2）。結(jié)果表明，木霉TC24的菌絲生長速度快于致病菌，從而對病菌的生長產(chǎn)生抑制作用，平均抑制率均超過50%。同時，木霉TC24還可以寄生在病菌菌絲上，覆蓋度級別分別為Ⅱ級和Ⅲ級，其中，對AG3和AG5兩種立枯絲核菌的覆蓋度可達(dá)100%，同時，可以完全抑制絲核菌產(chǎn)生菌核（圖4，圖5）。以上結(jié)果表明，通過抑制及寄生的方式，木霉TC24可以掏病原真菌菌絲的正常生長。

2.5 TC24對立枯絲核菌抑菌的掃描電鏡觀察

本研究中以AG3型立枯絲核菌為代表，收集木霉TC24與其對峙培養(yǎng)10 d的樣品進行掃描電子顯微鏡的觀察。結(jié)果顯示：TC24可通過并行（圖6a）或纏繞（圖6b）的方式寄生于AG3型絲核菌的菌絲上。寄生過程中可完全抑制絲核菌的菌核產(chǎn)生以及菌絲的正常生長。

3結(jié)論與討論

木霉Trichoderma spp.是廣泛分布于自然界并具有較高應(yīng)用價值的土棲真菌，可高效生產(chǎn)木霉胞外酶（如幾丁質(zhì)酶等）[10]。由于它們具有較強的營養(yǎng)和空間競爭能力、寄生作用、分泌抗菌代謝產(chǎn)物、激活植物防御反應(yīng)及促進植物生長等特點，很多種被廣泛用于植物保護，以控制植物病原菌和減少病害發(fā)生的嚴(yán)重程度[11]。

本研究從黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)玉米田的土壤內(nèi)分離獲得一株木霉TC24，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列比對鑒定為擬康寧木霉T.koningiopsis。通過馬鈴薯薯塊活體抑菌試驗和培養(yǎng)基上的對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌株對馬鈴薯多種病原真菌（接骨木鐮孢、2種融合群的立枯絲核菌和早疫病菌）具有抑制作用，且對病原菌菌絲生長的抑制率和覆蓋度超過50%。TC24對立枯絲核菌的覆蓋度可達(dá)100%，可完全抑制菌核的產(chǎn)生。

關(guān)于擬康寧木霉的生防作用，Moreno等[12]2009年報道其具有生防和誘導(dǎo)植物抗性的作用，可拮抗根串珠霉Thielavoiopsis basicola、擬輪枝鐮孢Fusarium verticillioides和尖鐮孢F.oxysporum。Ruangwong等[11]研究發(fā)現(xiàn)擬康寧木霉菌株P(guān)SU3-2可防治辣椒采后由膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides引起的炭疽病。在我國，Chen等[13]從三七Panax notoginseng植株上分離得到一株擬康寧木霉，其對草莖點霉Phoma herbarum、柔毛鐮孢Fusarium locci ferum、木棲柱孢霉Scytalidiumlignicola和黑附球菌Epicoccum nigrum有較好的拮抗效果；康彥平等[14]從感染花生的核盤菌Sclero-tinia sclerotiorum菌核上分離到一株擬康寧木霉菌株TM，對核盤菌菌絲生長及菌核的形成有較好的抑制作用；羅梅等[9]從藥用植物金絲皇菊Chrysan-themum morifolium‘Huangju’上分離到一株擬康寧木霉菌株Tkl，其對金絲皇菊枯萎病菌（尖鐮孢F.oxysporum）和柑橘炭疽病菌（膠孢炭疽菌C.gloeosporioides）具有拮抗作用。本研究分離獲得的擬康寧木霉TC24對馬鈴薯多種病原真菌均具有拮抗作用，可通過競爭生長及寄生作用對病原真菌菌絲生長、菌核形成等造成影響，從而降低發(fā)病的嚴(yán)重性。今后，將利用該菌株及其代謝產(chǎn)物進行田間