蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性及犆狔狋犫基因序列分析

王麗　侯琿　朱佳紅等

關鍵詞 蘋果輪紋病；葡萄座腔菌；吡唑醚菌酯；敏感性；細胞色素b基因

中圖分類號：S 482.92 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022383

近些年蘋果產業給中國農業經濟帶來了巨大的效益，栽培面積和區域逐步穩定和集中，種植面積和產量均居全球第一。然而作為蘋果生產大國的中國與其他貿易大國相比，蘋果品質不高、管理水平不足等客觀問題仍然存在[1]。其中，病害的發生嚴重影響蘋果的質量和產量，成為產業發展中的瓶頸。蘋果輪紋病（apple ring rot）主要由Botryo-sphaeria dothidea引起，在歐美認為是白腐病（white rot），因后期病瘤開裂脫落造成粗皮，所以也叫粗皮病等，在全球不同蘋果產區均有發生[1]。該病害是中國蘋果生產中的重要病害之一，通常情況下能導致減產25%，發病嚴重的不套袋果園病果率高達80%，枝干上輪紋病發病率嚴重時高達77.6%[3]。

目前，仍然將化學防治作為蘋果輪紋病的主要防控措施。常用的殺菌劑包括苯并咪唑類（MBCs）、甾醇去甲基化抑制劑（DMIs）和甲氧基丙烯酸酯類（Qols）等[4]。然而，不使用登記農藥及超劑量施用農藥等違規情況十分常見，致使果品質量安全得不到保證。而且長期單一、大量使用殺菌劑，蘋果輪紋病菌對藥劑的敏感性已有所下降[3]。關于蘋果輪紋病菌對MBCs類殺菌劑的敏感性研究屢見報道[6]，研究發現B.dothidea已對這類殺菌劑產生了E198A型抗性[7]。由于DMIs類殺菌劑對蘋果輪紋病有良好的防效，其在蘋果上應用越來越廣泛，國內學者研究了蘋果輪紋病菌對這類殺菌劑的敏感性[4，6，8]。然而，關于蘋果輪紋病菌對QoIs類殺菌劑的敏感性研究較少。

Qols類殺菌劑作用于線粒體細胞色素b（Cytb），通過與細胞色素bc1復合物結合，阻斷呼吸途徑中的電子轉移，導致由于缺乏三磷酸腺苷造成能量缺乏[9]。有的植物病原菌當Cytb受到抑制時，其交替氧化酶（AOX）呼吸途徑被啟動補償能量，而水楊肟酸（SHAM）等物質能夠阻礙植物病原菌的AOX呼吸途徑，所以在研究病原菌對此類殺菌劑的敏感性試驗中，為了避免AOX途徑的干擾，通常加入適當濃度的SHAM[10]。同時在研究不同病原菌對QoIs類殺菌劑的敏感性時發現，SHAM添加與否對病原菌敏感性影響不同，說明不同病原菌的細胞色素氧化酶呼吸途徑被QoIs殺菌劑抑制時AOX途徑的啟動情況存在差異[11]。關于蘋果輪紋病菌受到QoIs類殺菌作用時AOX水平尚不明確。

據報道，QoIs類殺菌劑作用位點單一，因此病原菌對其很容易產生抗性。在許多植物病原菌中發現了對此類殺菌劑的抗性，并且已經廣泛研究了其抗性機制。例如，蘋果黑星病菌Venturia inaequal-is，香蕉葉斑病菌Mycosphaerella fijiensis，鏈格孢屬真菌Alternaria spp.，指狀青霉Penicillium dig-itatum和番茄白粉病菌Leveillula taurica等病原菌的靶標基因測序結果表明，Cytb基因中的第143位密碼子由GGC突變為GCC，即G143A型突變，導致菌株對QoIs類殺菌劑的高抗性[12-16]。在超過20種真菌的抗性菌株中檢測到G143A突變。另外，其他位點氨基酸變化也可以導致抗藥性發生，例如，第129位氨基酸由苯丙氨酸轉變成亮氨酸（F129L）以及G137R型突變等已在病原真菌中發現，但抗性水平低于G143A型突變[17-18]。然而，也有研究發現，在一些對QoIs類殺菌劑敏感性下降的植物病原菌中，沒有發現Cytb基因突變，關于這類的抗性機理還不明確，需進一步研究[19-20]。

吡唑醚菌酯屬于QoIs類殺菌劑，具有內吸治療作用，對多種植物病原真菌表現出優良的活性[21]。據報道其已在我國蘋果園中使用多年，對蘋果輪紋病有較好的抑制作用[22]，至今為止沒有關于B.do-thidea對吡唑醚菌酯產生抗性的報道。鑒于上述情況，本研究對國內不同地區蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性進行了測定，建立其敏感性基線；對敏感性不同的蘋果輪紋病菌菌株的Cytb基因部分序列進行測序分析，研究靶標基因中是否產生抗性相關的點突變。旨在為制定蘋果輪紋病的科學防控方案和抗性治理策略提供技術支撐，并為解析QoIs類殺菌劑的抗性機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試菌株

2018年至2019年，從中國9省市的蘋果產區采集有輪紋病癥狀的枝條或果實病樣。采用組織分離法獲得440株分離物，經鑒定確定其為B.do-thidea[7]。選取80株菌株保存于4℃的PDA斜面上備用。供試菌株信息見表1。

1.2供試藥劑

96%吡唑醚菌酯原藥，江蘇劍牌農藥化工有限公司；99%的水楊肟酸（SHAM），Aladdin（上海）公司。均用丙酮溶解配成1×10μg/mL母液，于4℃保存備用。

1.3水楊肟酸對菌絲生長的影響

隨機選取20株蘋果輪紋病菌，在PDA培養基上培養5d備用，應用菌絲生長速率法測定不同濃度SHAM對病原菌菌絲生長的影響。配制含1、10、20、40、60、80μg/mL／mL和100μg/mL SHAM（終濃度）的PDA平板，以含丙酮的PDA平板為對照。用滅菌打孔器（d=5 mm）打取菌餅，菌絲面朝下接種到各平板中心，放人恒溫培養箱，25℃下培養。待對照平板菌絲長滿培養皿時，用數顯游標卡尺十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率。

抑制率=（空白對照菌落直徑－藥劑處理菌落直徑）／空白對照菌落直徑×100%。

1.4水楊肟酸對病原菌對吡唑醚菌酯敏感性的影響

選取12株蘋果輪紋病菌，添加1.3中確定的適當SHAM濃度，測定SHAM是否影響病原菌對吡唑醚菌酯的敏感性。分別配制含0、0.04、0.12、0.37、1.11、3.33、10μg／mL和30μg/mL吡唑醚菌酯（終濃度）和適當SHAM濃度的PDA培養基，以及含吡唑醚菌酯但不含SHAM的PDA平板。以添加相同量的丙酮和SHAM的平板為對照。每個菌株3個皿，每處理重復3次。待平板完全凝固后，按1.3的方法接種培養，測量菌落直徑及計算抑制率。以抑制率幾率值為縱坐標（y），吡唑醚菌酯濃度對數為橫坐標（x），計算毒力回歸方程、相關系數（r）及EC等。

1.5蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性測定

根據1.4的結果，添加SHAM不影響B.do-thidea菌株對吡唑醚菌酯敏感性，故此試驗不添加SHAM。依據1.4的方法，測定供試80株蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性。然后以敏感基線的10倍為鑒別濃度測定所有440株菌株對吡唑醚菌酯的抗性。在含有鑒別濃度殺菌劑的培養基上，敏感菌株的菌絲生長受到嚴重抑制（抑制率大于80%），而抗性菌株則不受影響或受到影響有限[23]。

1.6蘋果輪紋病菌部分Cytb序列分析

據報道，病原菌對QoIs殺菌劑產生抗性是靶基因Cytb基因點突變導致氨基酸突變引起的，主要突變類型包括G143A和F129L，另外G137R等類型的突變也有報道。本試驗選取對吡唑醚菌酯敏感性較低和較高的菌株各6株。使用DNA提取試劑盒提取其基因組DNA，PCR擴增Cytb基因含常見突變位點的片段。根據GenBank中B.dothidea的Cytb序列（KY801668.1）設計了2對引物，Cytb-07F/R：5′-AGGTGTACATTTTGATTATGAGG-GA-3′/5′-AAGATTGCAGAAAGATTGTTACT-CG-3′和Cytb-6F/R：5′-AACCTAGATTCAGAAA-ATATTAGAA-3′／5′-CGTGTATTCAATTAAA-ACTAGTATA-3′，分別擴增含第129位氨基酸的1285bp基因片段和含第137位、第143位氨基酸的1492 bp基因片段。PCR擴增體系（25μL）為：PCRMaster Mix 12 μL，10 μmol／L Cytb-07F/R（或Cytb-6F/R）引物各1μL，模板DNA 1μL和超純水10μL。擴增條件為：94℃預變性2 min; 94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸10min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京六合華大基因科技有限公司測序。測序結果用BioEdit軟件對不同敏感菌株的Cytb基因序列進行比對分析。

1.7數據統計分析

采用DPS和Excel對試驗數據進行統計分析，應用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD進行顯著性檢驗，顯著水平設置為α=0.05，

2結果與分析

2.1水楊肟酸對病原菌菌絲生長及其對吡唑醚菌酯毒力的影響

不同濃度的SHAM對蘋果輪紋病菌菌絲生長的抑制作用不同（表2），最高濃度100μg/mL下抑制作用最強，達到19.96%，且與其他濃度的抑制率差異顯著；SHAM濃度為1μg/mL和10μg/mL時對菌絲生長的抑制率與對照之間差異不顯著；雖然現有報道中經常選用對病原菌菌絲生長抑制率小于30%的SHAM濃度[24]，但本研究中最高濃度抑制率僅為19.96%，綜合考慮最終將添加40μg/mL的SHAM應用到敏感性試驗中。試驗結果表明，添加SHAM不影響B.dothidea菌株對吡唑醚菌酯的敏感性，在添加或不添加SHAM件下吡唑醚菌酯對12株菌株的ECso均差異不顯著（表3），對其進行多因子分析，取樣適切性量數（Kaiser-Meyer-Olkin，KMO）值為0.50，說明SHAM是否存在與B.do-thidea菌株對吡唑醚菌酯的敏感性之間相關性差。

2.2蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性

B.dothidea菌株對吡唑醚菌酯的敏感性試驗表明，80株菌株的ECso范圍是0.43～8.40μg/mL，平均ECso是（2.95±2.11》μg/mL。結果（圖1）顯示，蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性頻率符合近似正態分布（W=0.9699，P>0.05），因此可將此EC平均值作為蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的相對敏感性基線。從表4可知，采自中國9個地區的蘋果輪紋病菌的平均EC之間差異不顯著。對440株菌株的抗性檢測結果顯示沒有抗性菌株。

2.3蘋果輪紋病菌Cytb序列分析

本試驗擴增了吡唑醚菌酯敏感性較低和較高菌株的Cytb基因片段。測序結果表明，該序列涵蓋了與吡唑醚菌酯抗性有關的3個密碼子（F129、G137和G143）堿基序列（TTC、GGT和GGT），序列分析發現在131位密碼子和143位密碼子后分別有一段1356 bp和1061 bp的內含子插入（圖2a）。研究認為工型內含子其5′端上游的外顯子末尾堿基是T，且其3′端下游外顯子首個堿基是G[25]。因此，Cytb基因143位密碼子后內含子為工型內含子。此外，序列比對發現敏感性較低的菌株（Bd-347）和敏感性較高的菌株（Bd-250）堿基序列沒有差異（圖2b），各菌株在143位密碼子后都有長度為1061 bp的內含子插入，其他菌株Cytb基因序列也都一樣。結果說明B.dothidea菌株沒有產生引起吡唑醚菌酯抗性的Cytb基因點突變。

3結論與討論

蘋果輪紋病的病原菌B.dothidea是一種園藝植物病原菌，能夠感染多種木本植物[26]。生產上對其引起的病害仍然是以化學防治為主。QoIs類殺菌劑具備杰出的抑菌作用，在化學防治中廣泛應用。例如，此類殺菌劑中的吡唑醚菌酯已在我國蘋果園中使用多年[22]。本研究測定了中國9省市蘋果產區80株蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性，建立了蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感基線，可為蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的抗藥性監測提供理論依據。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的敏感性試驗中通常加入旁路氧化途徑抑制劑SHAM，但對不同的病原菌其加入濃度也不盡相同[11]。本研究中100μg／mLSHAM的高濃度下對菌絲的抑制率僅為19.96%，綜合考慮最終將添加40μg／mL SHAM應用到敏感性試驗中。同時還發現SHAM存在與否不影響B.dothidea菌株對吡唑醚菌酯的敏感性。因此，本研究認為在測定B.dothidea對吡唑醚菌的敏感性時，SHAM不是必需添加的。

此外，本研究分析B.dothidea菌株的Cytb基因序列時發現，在Cytb基因的143位密碼子后面插入一個內含子（長度為1061 bp），這個內含子的插入目前在B.dothidea菌株中還未見報道。當病原菌中有此內含子插入時，G143A位點的突變將阻礙內含子配對和剪接過程，并產生有缺陷的Cytb，攜帶G143A突變和上述內含子的突變菌株會在某個時間點存在，但是由于Cytb的缺陷可能會導致這些菌株的適合度降低，使其很快從群體中消失[25，27]。目前多種植物病原菌中已報道在143位密碼子后面有內含子插入，包括Botrytis cznerea，Moniliniafructicola，Guignardia bidwellii，Alternaria spp.以及Fusicladium rffusum等[25，28-31]。但至今為止，報道的G143A突變只存在Cytb基因143位密碼子后沒有緊跟內含子的病原菌中，而此密碼子后有緊跟內含子的病原菌中未曾報道產生此突變[27]。據此推斷B.dothidea很難對QoIs類殺菌劑產生G143A抗性突變。敏感性測定也沒發現吡唑醚菌酯抗性菌株。目前也沒有相關文獻報道B.dothidea對QoIs類殺菌劑產生抗性。因此在生產上可以推薦此類殺菌劑與其他類型殺菌劑交替使用防治蘋果輪紋病，尤其是對多菌靈產生抗性的地區。但病原菌對QoIs產生抗性的機理除Cytb基因G143A類型點突變導致的高水平抗性外，應該還有其他未知機理，還需進一步研究。且持續對蘋果輪紋病菌進行抗藥性研究，可實現對蘋果輪紋病更為有效的防治。

本研究表明，添加適量的水楊肟酸對蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯敏感性的影響不顯著，目前尚未發現對吡唑醚菌酯產生抗性的B.dothidea菌株，且蘋果輪紋病菌對吡唑醚菌酯的敏感性在不同產區差異不顯著。首次發現B.dothidea菌株的Cytb基因143位密碼子后面有一個內含子的插入。