超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定柑橘中的草甘膦及其代謝物殘留

張夢娜　楊云　王立平等

關(guān)鍵詞 農(nóng)藥殘留；柑橘；草甘膦；代謝物

中圖分類號：S 481.8 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022319

柑橘是我國種植面積大、產(chǎn)量高的水果之一，其農(nóng)藥殘留問題一直被公眾廣泛關(guān)注。草甘膦（glyphosate）是由美國孟山都公司開發(fā)的一種內(nèi)吸廣譜型非選擇性除草劑，其除草機制主要是通過抑制植物體內(nèi)的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)合成受到干擾，導(dǎo)致植株死亡，對多年生深根雜草的地下組織破壞力很強[1-3]。草甘膦因其具有高效、低毒的特點已成為我國柑橘園用量最大、使用頻次最高的除草劑[4]。目前，我國已有362個草甘膦制劑產(chǎn)品在柑橘上取得了登記。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2021）規(guī)定草甘膦在柑、橘、橙中的最大殘留限量為0.5 mg/kg。草甘膦在我國植物源性食品中的殘留物定義和膳食風(fēng)險評估定義分別為草甘膦和草甘膦與氨甲基膦酸（AMPA）之和，以草甘膦表示。隨著耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物在全球推廣種植，2013年世界糧農(nóng)組織／世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留聯(lián)合專家會議（Joint Meeting on Pesticide Residues）根據(jù)草甘膦在轉(zhuǎn)基因作物中的代謝試驗結(jié)果將其在玉米、大豆、油菜中的殘留物定義修改為草甘膦與N-乙酰草甘膦之和，以草甘膦表示，并將草甘膦在植物源性和動物源性食品中膳食風(fēng)險評估定義修改為草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA之和，以草甘膦表示[5]。2016年，歐洲食品安全局（EFSA）提議將草甘膦在所有植物源性食品中的殘留物定義修改為草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA之和，以草甘膦表示，并將其膳食風(fēng)險評估定義修改為草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA之和，以草甘膦表示[6]。隨著草甘膦的大量、長期使用，較多的草甘膦直接進入土壤或通過飄移進入水體和大氣而污染環(huán)境，同時在植物中殘留的草甘膦及其代謝物通過食物鏈對動物和人體產(chǎn)生潛在的健康風(fēng)險。2017年，國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將草甘膦歸類為2A類致癌物，即很可能對人類致癌，并對草甘膦在食品中的殘留進行嚴(yán)格管控[3]。因此，建立一種快速、穩(wěn)定且靈敏度高的草甘膦及其代謝物在柑橘中的殘留檢測方法具有重要意義。

草甘膦及其代謝物屬于強極性化合物，極易溶于水，不溶于有機溶劑，同時其分子結(jié)構(gòu)中不含有發(fā)色和熒光基團，從食品中提取、檢測難度較大。目前草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫檢測法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]。其中，毛細(xì)管電泳法和離子色譜法具有簡單快速的優(yōu)勢，但其方法定量限不能滿足殘留分析方法的要求。色質(zhì)聯(lián)用因其具有較高的靈敏度，在草甘膦的檢測中被廣泛應(yīng)用，但在前處理過程中均需衍生化，步驟繁瑣、耗時長，且反應(yīng)條件難以控制，無法滿足大量樣品的快速檢測[9]。

本研究結(jié)合陰離子分離色譜柱，并通過對前處理方法和色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化，首次建立了一種基于反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測柑橘中草甘膦及其代謝物N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA的方法，該方法操作簡單，無需衍生化，為植物源食品中草甘膦及其代謝物的快速、準(zhǔn)確檢測提供了方法借鑒。

1材料與方法

1.1藥劑與試劑

草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品（CAS： 1071-83-6，99.3%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；N-乙酰草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品（CAS： 129660-96-4，99.3%），中國天津阿爾塔科技有限公司；氨甲基磷酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：1066-51-9，98%），美國Worcester公司；N-乙酰氨甲基磷酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS： 57637-97-5，純品，96.7%），美國Worcester公司；乙腈（分析純）、甲醇（分析純）、甲酸（分析純）從北京精細(xì)化工有限公司購得；N-丙基乙二胺（PSA，40μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C，40μm）和石墨化炭黑（GCB，40μm）等分散劑均從天津博納艾杰爾科技有限公司購得；超純水由Milli-Q（Bedford，MA，美國）制得。

1.2儀器設(shè)備

檢測儀器為AB SCIEX4500高效液相色譜質(zhì)譜儀（Triple Quad 4500型），Triple QXW-80A渦旋混合器，Scientific industries，美國；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；SIGMA 1-15離心機，德國Sigma公司；TG16-WS臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；G501A型電子天平（精確度0.1g），江蘇常熟衡器廠；電子分析天平（精確度0.0001g），德國Sartorious公司；醫(yī)用無菌注射器，上海治宇醫(yī)療器械有限公司；微孔Filter Unit濾膜（有機相，0.22μm），MILLEX-GV，美國密理博公司。

1.3試驗方法

1.3.1樣品前處理

柑橘樣品（果肉、全果）經(jīng)勻漿機均質(zhì)后稱取2g試樣（精確至0.1g）至50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入20 mL 0.5%甲酸水，劇烈振蕩10 min，超聲5min后以4000r/min離心5min，吸取1.5 mL的上清液至2mL已加入40mg C的塑料離心管中，渦旋混勻1min，以10000r／min離心5min，經(jīng)0.22μm的有機濾膜過濾至進樣小瓶中待測。

1.3.2色譜-質(zhì)譜檢測條件

色譜條件：色譜柱為Metrosep A Supp 5 col-umn （4.0 mm×150 mm，5μm，Metrohm公司）；進樣量50μL，流速0.6 mL／min;柱溫40℃；流動相A為水，流動相B為200 mmol／L碳酸氫銨溶液（含0.1%氨水）；梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式；氣簾氣：35 psi；離子化電壓：－4500 V;源溫度600℃；噴霧氣：55 psi；輔助加熱氣：45 psi；數(shù)據(jù)采集采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2結(jié)果與分析

2.1提取劑的選擇

在QuEChERS方法中，乙腈作為最常用的提取劑，具有優(yōu)良的溶劑性能，能溶解多種有機、無機和氣體物質(zhì)；甲醇溶解性好、滲透強，也是農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)中常用的提取溶劑之一。本研究考慮到目標(biāo)化合物的親水性質(zhì)，采用水、甲醇-水體系、乙腈-水體系進行提取效果的優(yōu)化，提取液總體積為20 mL，混合提取液水和甲醇體積比為1：1，水和乙腈體積比為8：2；其他前處理條件保持一致。結(jié)果如圖1所示，對于柑橘全果而言，采用乙腈-水體系提取草甘膦的回收率為130%，不滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》（NY/T788-2018）添加水平為0.01～0.1mg/kg時，目標(biāo)化合物的回收率為70%～120%的要求；而水或甲醇-水作為提取液時，草甘膦及其代謝物回收率均在70%～110%，說明水和甲醇一水體系提取均滿足回收率要求，且回收率之間差異不明顯；由于水作為提取劑具有經(jīng)濟成本低、環(huán)境相容性好及試驗操作簡便快捷等特點，所以在后續(xù)試驗中采用水作為提取劑。在提取液中加入適量甲酸可以使酸性化合物呈現(xiàn)分子態(tài)，進而增加其在提取劑中的溶解性，本研究比較了水、0.5%甲酸水、1%甲酸水及2%甲酸水的提取效果，結(jié)果如圖2所示，隨著甲酸濃度的增加柑橘全果中N-乙酰草甘膦回收率逐漸升高，且當(dāng)甲酸濃度大于0.5%時，N-乙酰草甘膦回收率超過110%；而在柑橘果肉中，隨著甲酸濃度的增加4種目標(biāo)物的回收率基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且甲酸濃度為0.5%時提取效果最好。所以，最終選取0.5%甲酸水作為提取劑。

2.2凈化劑的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中常用的凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C）及石墨化炭黑（GCB）。PSA可以有效去除脂肪酸、有機酸和一些極性色素及糖類物質(zhì)；C主要去除一些非極性組分；GCB主要吸附一些具有平面結(jié)構(gòu)的化合物，如色素等。柑橘全果和果肉中有機酸、糖類、色素含量較高，容易對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，本研究對50 mg PSA（T1）、50 mg C18 （T2）、20 mgGCB（T3）以及40 mg PSA+10 mg GCB（T4）、40 mg C+10 mg GCB（T5）5種凈化劑進行了凈化效果對比。經(jīng)5種方式凈化后，提取液的上清液均變澄清，說明5種凈化方式都能很好地去除色素。如圖3所示，使用PSA作為凈化劑時，草甘膦、N-乙酰草甘膦及N-乙酰AMPA回收率均低于50%，主要是由于PSA在吸附雜質(zhì)的同時，也對強極性的草甘膦及其代謝物有較強的吸附作用，導(dǎo)致回收率不能滿足要求；單獨使用GCB時柑橘全果中4種目標(biāo)化合物的回收率均大于120%，使用C18+GCB組合作為凈化劑時柑橘果肉中3種目標(biāo)化合物的回收率大于120%，不滿足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》（NY/T788-2018）要求；單獨使用C進行凈化時，柑橘全果和果肉中4種目標(biāo)化合物回收率均在70%～110%，滿足回收率的要求。所以，最終選取采用40 mg C18作為凈化劑對提取液進行凈化。

2.3方法驗證

2.3.1線性關(guān)系

用超純水和柑橘全果及果肉空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x，mg/kg）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表3所示，在0.05～1mg/kg范圍內(nèi)，本方法線性回歸相關(guān)系數(shù)R均大于0.99，線性關(guān)系良好。

2.3.2基質(zhì)效應(yīng)分析

影響基質(zhì)效應(yīng)的因素有很多，基質(zhì)類型、化合物的理化性質(zhì)以及樣品前處理過程均可對基質(zhì)效應(yīng)造成影響。基質(zhì)效應(yīng)的存在會影響殘留農(nóng)藥的準(zhǔn)確定量分析，通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，可以判斷基質(zhì)效應(yīng)的大小[11]。即當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在±20%之間時，被認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較低；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在±50%之間時，被認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)中等；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)超出±50%時，被認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較強[12]。如表3所示，柑橘果肉和全果對草甘膦及其代謝物存在不同程度的基質(zhì)增強和減弱效應(yīng)，其中草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA在果肉和全果中的基質(zhì)效應(yīng)在－22.9%～20.2%，表明存在較弱的基質(zhì)效應(yīng)，可以忽略；而AMPA在柑橘果肉和全果中的基質(zhì)效應(yīng)分別為68.6%和72.0%，表明存在較強的基質(zhì)增強作用，采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液定量可能導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高。因此，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法對基質(zhì)效應(yīng)進行了補償，以提高定量準(zhǔn)確性[13]。

2.3.3回收率和定量限

在空白柑橘全果和果肉樣品中添加0.05mg/kg（檢測方法能夠穩(wěn)定測定的最小值），0.5 mg/kg（MRL值），1.0mg/kg（涵蓋樣品中可能的最大值）3個不同水平的4種混合目標(biāo)物，每個加標(biāo)水平設(shè)5個重復(fù)。結(jié)果表明（表4），柑橘全果中草甘膦及其3種代謝物在3個加標(biāo)水平下的回收率范圍為70.5%～109.5%，RSD為3.2%～10.1%，柑橘果肉中草甘膦及其3種代謝物在3個加標(biāo)水平下的回收率范圍為73.9%～103.0%，RSD為0.6%～7.9%，滿足殘留分析方法的要求，相關(guān)譜圖見圖4。

2.4實際樣品檢測

將在北京超市及農(nóng)貿(mào)市場購買的柑橘，按上述方法進行前處理和檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草甘膦及其代謝物在柑橘全果和果肉中均未檢出。

3結(jié)論

首次建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）同時測定草甘膦及其代謝物N-乙酰草甘膦、氨甲基磷酸（AMPA）和N-乙酰AM-PA在柑橘中的殘留檢測方法。草甘膦及其代謝物可在7min內(nèi)完成分離檢測，在0.05～1 mg/kg濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；樣品經(jīng)過0.5%甲酸水提取，十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（C）凈化，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法對基質(zhì)效應(yīng)進行補償，草甘膦及其代謝物在柑橘中的回收率在70.5%～109.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.6%～10.1%，最低檢測濃度（LOQ）為0.05mg/kg。與傳統(tǒng)方法相比，該方法操作簡便，準(zhǔn)確可靠、無需衍生化，可滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，并可用于大量樣品的快速檢測。