白及銹病的病原鑒定及其田間防治藥劑篩選

徐明癑　江健偉　劉艮森等

關鍵詞 白及；銹??；Coleosporium bletiae；病原鑒定；藥劑防治

中圖分類號：S 435.672 文獻標識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2022211

白及Bletilla striata是多年生蘭科白及屬植物，廣泛分布于中國、日本、韓國和緬甸。在我國，現多分布于湖北、貴州、廣西、四川、云南等地[1]。白及是我國傳統蘭科藥材之-[2]，其藥用部分主要是富含白及多糖膠的地下假鱗莖。白及多糖膠具有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效，常用于治療消化道黏膜損傷、潰瘍、出血、擦傷和燒傷、皮膚皸裂等[3-5]。由于白及具有較高的藥用、觀賞和經濟價值，對其需求量不斷增大，愈來愈多的野生資源被廣泛掠奪。因其繁殖能力較低，生長速度緩慢，導致我國野生白及急劇減少，瀕臨滅絕，現已被《中國植物紅皮書——稀有瀕危植物》收錄，同時也被寫入了《瀕危野生動植物國際貿易公約》保護種類[6-7]。

近年來，隨著白及需求量增加，價格迅速上漲，大規模人工種植的白及越來越多[8]。而由于栽培管理措施、田間小氣候等因素的影響，白及病害種類、分布、發生面積增加，危害逐年加重。已報道的病害有：由Fusarium commune、F.asiaticum、F.ipomoe-ae、F.solani和Epicoccum sorghinum侵染引起的白及葉斑病[9-13]；Colletotrichum orchidophilum和C.fruc-ticola引起的炭疽病[14-15]3；Sclerotium rol fsii引起的白絹病[16]；Phytophthora nicotianae引起的疫病[17]；由Dactylonectria torresensis引起的根腐病和F.fujikuroi引起的莖腐病[18-19]；Coleosporiumbletiae引起的白及銹病[20]等。

白及銹病具有傳播性強、不易防治的特點，其在湖北地區于每年4月中旬開始發生，一直可以持續至11月上旬，特別是5月-8月是銹病的大暴發時期。然而，自發現白及銹病以來，其病原體特征尚未被清楚地描述，其有效防治藥劑鮮見報道，這可能也是導致該病未能很好防治的主要原因。

2018年6月，白及銹病在華中地區，特別是湖北省的多個白及種植區大面積發生，發病率超過50%，有的種植區甚至達到90%。本研究從2018年6月起在湖北省恩施州來鳳縣白及種植區進行白及銹病調查，利用形態學和分子生物學相結合的方法對其病原進行研究，同時選擇5種藥劑對該病進行田間防治試驗。

1材料與方法

1.1樣品采集

2018年—2019年，在湖北省恩施州來鳳縣白及種植區（29°58′N，109°40′E，海拔558m）調查白及銹病發生情況，發現銹病發病率普遍高于80%。分別于2018年6月和2019年10月采集帶有明顯病征的白及銹病病株和病葉樣品，放人無菌的牛皮紙袋中保存并編號，帶回實驗室后立即進行顯微觀察。并分別收集其夏孢子和冬孢子堆，放置于干燥的無菌離心管中，4℃保存備用。為方便描述，將本研究白及銹病病原編號為BSC1。

1.2致病性測定

選取長勢一致的健康2年生白及植株移栽于塑料育苗盆中，每盆4株，使用PE手套摩擦白及葉片上下表面，擦掉蠟質層。隨后將收集的夏孢子配制成孢子懸浮液（105個/mL），每株噴灑10 mL孢子懸浮液，對照噴灑等量無菌水，每個處理2盆。所有接種后的植株放置于自然環境（白天約30℃，夜晚約15℃，相對濕度80%～100%）中。每天觀察，45 d后拍照記錄發病情況。根據病菌的顯微形態對發病葉片上的病原再鑒定，進行柯赫氏法則驗證。

1.3形態學觀察

取具有典型病征的樣本，在連續變倍體視顯微鏡（南京永新光學有限公司，NS2-608T，中國）下對其冬孢子堆進行徒手切片，并用無菌針挑取病原菌的夏孢子和冬孢子，以無菌水作為浮載劑在顯微鏡（Nikon，DS-Ri2，日本）下觀察并測量其大小。

1.4分子系統學鑒定

取銹病病原（ BSCl）的夏孢子約200 mg，置于1.5mL無菌離心管中，采用改良CTAB法提取其基因組總DNA[21]。利用核糖體內轉錄間隔區（in-ternal transcribed spacer，ITS）和核糖體大亞基（large subunit，LSU）基因序列引物進行PCR擴增，引物委托武漢華大基因科技有限公司合成，序列見表1。

PCR反應體系（50μL）：DNA模板3μL，2×SuperStar Omni PCR Master Mix（Genestar，中國）25μL，正、反向引物（10μmol／L）各2μL，ddHO補足至50μL。ITS和LSU基因的PCR擴增程序：95℃預變性5 min; 95℃變性45 s，55℃退火45s，72℃延伸30s，共34個循環；72℃再延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送武漢華大基因科技有限公司進行測序。所獲得的序列經DNAstar峰圖校正后，利用GenBank數據庫的BLASTn工具進行同源性比對，并選擇下載相應參考序列。使用在線多序列比對工具MAFFT[24]（http：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）分別對ITS和LSU序列進行多序列比對，隨后經修剪和拼接ITS和LSU序列，并在MEGA7.0中構建系統發育樹，進行建樹模型評估選擇，進化樹采用自展法（ bootstrap）進行檢測評估，1000次循環。

1.5田間防治藥劑篩選

供試藥劑：10%苯醚甲環唑水分散粒劑（WG），先正達南通作物保護有限公司；15%三唑酮可濕性粉劑（WP），江蘇七洲綠色化工股份有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫植物保護（江蘇）有限公司；12%萎銹靈可濕性粉劑（WP），陜西恒田生物農業有限公司；80%代森錳鋅可濕性粉劑（WP），美國陶氏益農公司。

試驗地點為湖北省來鳳縣白及人工種植基地。試驗共設置6個處理：1）10%苯醚甲環唑WG60g／hm（有效成分用量，下同）；2）15%三唑酮WP180 g／hm；3） 250g/L吡唑醚菌酯EC 180g／hm；4） 12%萎銹靈WP 108 g／hm；5）80%代森錳鋅WP 1200 g／hm；6）清水對照。每處理重復3次，共18個小區，每個小區面積30 m，隨機區組排列。試驗于2020年4月25日至5月16日進行，共施藥3次，每次間隔7d。施藥時，按照常規施藥方式，使用背負式電動噴霧器（3WDB-20L）對白及葉片正反面和莖部均勻噴霧，空白對照處理噴施等量清水。試驗過程中，共調查4次，分別為施藥前病情指數調查（4月25日）、第1次施藥后7 d（5月2日）、第2次施藥后7 d（5月9日）和第2次施藥后14 d（5月16日）。每小區采用對角線五點取樣法，每點10株，每株調查最上方的3個葉片，記錄病葉發病面積，以每張葉片上病斑面積占整個葉面積的百分率進行分級[25]。分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占整片葉面積的5. 1%以下；3級：病斑面積占整片葉面積的5.1%～25%；5級：病斑面積占整片葉面積的25.1%～50%;7級：病斑面積占整片葉面積的50.1%～75%;9級：病斑面積占整片葉面積的75%以上。

根據調查數據按下式計算各處理小區的防治效果，并使用SPSS軟件處理調查數據，采用Duncan氏新復極差法對數據進行方差分析。

病情指數=∑（各級病葉數×相應級值）／（調查總葉數×最高級值）×100；

防治效果=[1－（藥劑處理區施藥后病情指數－藥劑處理區施藥前病情指數）／（空白對照區施藥后病情指數一空白對照區施藥前病情指數）]×100%。

2結果與分析

2.1田間發病癥狀

白及銹病的病原屬于專性寄生菌，具有較強的傳播能力。在田間，從4月至11月，其夏孢子可以反復侵染白及植株，發病率可達100%。該病發生初期，葉片正面呈現褪綠小黃斑（1～3mm），隨后葉背面出現散生、圓形、粉狀凸起的橘黃色夏孢子堆，直徑約1～5 mm，周圍有黃色暈圈。夏孢子是田間再侵染的主要來源。當病害發生嚴重時，整個葉片上密布幾十至上百個形狀大小不等的夏孢子孢子堆，導致葉片光合作用受阻，葉片扭曲、枯萎，最后脫落（圖1）。10月中旬以后，氣溫逐漸降低，在夏孢子堆周圍會出現紅褐色的冬孢子堆，呈圓環狀（圖2c）。

2.2病原夏孢子的致病性

接種夏孢子20 d后，白及葉片表面出現典型的淡黃色褪綠病斑，背面出現少量黃色夏孢子堆。45 d后，葉片下部（靠近葉鞘部）出現黃化、壞死和大量的孢子堆，癥狀與田間發病癥狀相似（圖1b～c）。

2.3病原夏孢子和冬孢子的形態

白及銹病病原的夏孢子呈卵圓形或長橢圓形，單細胞，表面有疣狀突起，（32.1±4.72）μm×（20.6±2.5）μm（n=30）（圖2a～b）。冬孢子堆生于葉背表皮，呈墊狀，橘黃色（圖2c）。冬孢子棍棒狀，由2～4個細胞組成（1～3橫隔膜），大小為（108. 48±10.84）μm×（17. 97±2.56）μm（n=30）（圖2d～e）。

2.4分子生物學鑒定

將獲得的白及銹病病原的ITS（636 bp）和LSU（650 bp）基因序列提交至GenBank數據庫，登錄號分別為MN108161和MN10 8162。利用ITS和LSU聯合基因序列，以K2模型構建neighbor-join-ing（NJ）系統發育樹，進化樹結果表明，白及銹病病原與4個鞘銹屬真菌Coleosporium euodiae HMBF-11、C.campanulae HMBF-41501、C.pedic-ularidis HMBF-74454、C.bletiae N87聚為一簇，其bootstrap支持率為99%。其中該銹病病原（BSCl）與C.bletiae N87聚為一個亞支，其bootstrap支持率為91%，表明白及銹病的病原為鞘銹菌屬真菌Coleosporium bletiae（圖3）。

2.5田間防治藥劑的篩選結果

5種藥劑對白及銹病的防治效果有較大的差異（表2）。250g/L吡唑醚菌酯EC與12%萎銹靈WP對白及銹病的防控效果最好，第1次施藥后7d防效均在78%以上，其中250g/L吡唑醚菌酯EC在第2次施藥后的第14天防效可達90%。80%代森錳鋅WP和15%三唑酮WP在本試驗中防效中等，二者無顯著差異，在第2次施藥后的第14天防效均可達到71%以上。10%苯醚甲環唑WG的防治效果最差，在整個施藥調查周期中，其防效僅在44%～57%之間。

3結論與討論

Coleosporium bletiae引起白及葉部銹病最早于1898年由日本學者Dietel報道[26]。根據其描述，C.bletiae夏孢子為橢球形，帶疣，冬孢子棒狀，由4個細胞構成，本研究結果與其描述相符，不同的是冬孢子大小為（108.48±10.84）μm×（17.97±2.56）μm，小于Dietel報道的150μm×25μm。據報道，我國臺灣、西藏和貴州等地的一些野生白及分布地有白及銹病發生[20，27-28]，但是僅對病害發生區域進行了記錄，沒有病原的具體信息。本研究首次報道了湖北省恩施地區白及銹病的發生特點，并對病原形態及分子特征進行了描述。

銹菌的生活史可以分為3種類型，包括長循環型（macrocyclic）、缺夏孢子型（demicyclic）和短循環型（microcyclic） [29]。全世界已經發現的鞘銹菌屬Coleosporium真菌約有100種[30]，大多數種的生活史是具有轉主寄主的長循環型，可以產生5種不同類型的孢子，包括性孢子（pycniospores）、銹孢子（aeciospores）、夏孢子（urediospores）、冬孢子（telio-spores）和擔孢子（basidiospores）[31-32]。本研究發現Coleosporium bletiae的夏孢子和冬孢子都是在其寄主（白及）上產生，而其轉主寄主尚不清楚，有待進一步深入研究。

白及銹病病原的傳染性極強，容易導致該病害嚴重發生，造成較大的經濟損失，高效防治藥劑的篩選是防治關鍵。關于白及銹病的田間防治，僅見楊帆等[33]報道了25%吡唑醚菌酯SC的防效最好，達到了91.23%，15%三唑酮WP次之，其防效為84.12%。本研究也獲得了類似的結果，250g/L吡唑醚菌酯EC對白及銹病的防治效果最好，在第2次施藥后14 d的防效為90.01%，另外，12%萎銹靈WP對白及銹病也具有較好的防治效果，其防效與250g/L吡唑醚菌酯EC相當。本研究中15%三唑酮WP第2次施藥后14d的防效僅為71.89%，這可能是由于三唑酮長期作為湖北地區白及銹病的主要防治藥劑導致病原出現了一定的抗藥性。因此生產上推薦12%萎銹靈WP和250g/L吡唑醚菌酯EC作為白及銹病的防治藥劑。