北疆棉花黃萎病發病率調查及土壤中黃萎病菌微菌核數量與種群類型分析

劉海洋　王偉　張仁福等

關鍵詞 棉花黃萎??；大麗輪枝菌；微菌核；落葉型菌株

中圖分類號：S 435.621.24 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022318

2021年新疆棉花種植面積占全國的82.8%，總產量占全國的89.5[1]，保障新疆棉花生產安全對于穩定全國棉花供給意義重大。然而，由于新疆棉花規?；N植，常年連作加重了棉花黃萎病的危害。多年流行學調查顯示，不同棉花種植區域黃萎病發生程度差異顯著。如，2015年巴楚縣、五家渠市、莎車縣等地發病棉田百分率分別為37.5%、21.7%和18.8%；圖木舒克市、沙雅縣一新和縣一庫車縣、庫爾勒市一尉犁縣一輪臺縣、沙灣縣一奎屯市等地發病棉田百分率均超過50%；阿克蘇地區、石河子市一瑪納斯縣一呼圖壁縣、烏蘇市一精河縣一博樂市等地發病棉田百分率均超過70[2]。發病嚴重地區可造成棉花減產30%以上[3]，成為制約新疆棉花可持續生產的重要因素。

國內棉花黃萎病的病原菌主要為大麗輪枝菌Verticillium dahliae，形成的休眠結構微菌核在土壤中可存活14年以上[4]，分泌的毒素可直接引起棉花葉片萎蔫壞死，最終造成棉株死亡。大麗輪枝菌種群演化機制復雜，進化出了多元的種群結構。根據對棉花致病的嚴重程度和癥狀類型，將大麗輪枝菌分為落葉型和非落葉型兩種致病型，落葉型菌株的致病性強于非落葉型菌株[5-6]，落葉型菌株引發的黃萎病病情發展迅速，嚴重時常導致棉花大面積光稈，危害很大[7]。土壤中微菌核的數量與棉花的生長季節有一定相關性，亦與棉花黃萎病發生趨勢高度一致[8]。但是，不同棉區生態環境、種植棉花品種等存在較大差異，可能引起棉花黃萎病發生程度的差異。常年棉花連作又進一步加重了土壤棉花黃萎病菌的積累和變異分化。如，2004年新疆棉區強致病力落葉型黃萎病菌菌株存在比例很低[9]，而目前局部地區落葉型菌株已占80%以上，甚至100[10]。但目前新疆棉花黃萎病相關研究主要集中在分離自棉株的黃萎病菌上，并未對新疆棉田土壤中黃萎病菌種群進行系統研究。

快速定量土壤中黃萎病菌的微菌核數量，明確棉田土壤中黃萎病菌落葉型和非落葉型菌株的分布狀況，對研究新疆棉花黃萎病流行演替規律及制定綜合防治措施具有重要意義[11]。因此，本文對北疆主要植棉地區棉田黃萎病發生情況、土壤中微菌核數量及黃萎病菌種群類型進行了調查研究，以期更好地指導新疆棉花黃萎病防控，保護新疆棉花生產安全。

1材料與方法

1.1棉花黃萎病發生情況調查

2021年7月25日開始對呼圖壁縣、瑪納斯縣、石河子市、沙灣縣、奎屯市、烏蘇市、精河縣、博樂市8地共計199塊棉田棉花黃萎病發生情況進行了抽樣調查，按調查先后順序進行編號。每塊棉田選擇與田埂直線距離約100 m處設第1調查取樣點，以50 m距離為間隔在第1點側邊依次設置第2、3調查取樣點，每點連續調查50株棉花，每塊棉田共計調查150株，計算發病率。

發病率=（發病株數／調查總株數）×100%。

1.2棉田土壤采集

采集發病調查點棉株根圍5～10cm耕層土壤，每點采集200g土壤，每塊棉田采集3個樣點，共600g土壤，裝入封口袋，做好標記，用于分離土壤中的黃萎病菌，并檢測統計微菌核數量，同時采集部分未發病調查點土壤進行黃萎病菌分離驗證。共計采集172份土壤，陰涼處晾干后保存于4℃冰箱備用。

1.3土壤中棉花黃萎病菌微菌核分離

將1.2中保存的晾干土壤樣品過30目篩，稱取6g放入盛有200 mL滅菌水的三角瓶中，加入少量玻璃珠，靜置5 min，120r/min振蕩20 min。然后倒入上層100目，下層400目的細篩，在自來水下將泥土沖洗干凈。留在下層篩網上的土壤殘留物全部轉移到100 mL三角瓶中，用無菌水定容到30 mL，用移液槍每次吸取1mL均勻涂布于選擇性培養基（MSN） [12]表面，接種5皿，待培養基上的土樣液晾干后，密封在28℃下黑暗培養7d。每5皿的檢驗結果數目之和就是所測1g土樣中所含微菌核數量。3次重復。

1.4土壤中棉花黃萎病菌純化

挑取步驟1.3 MSN培養基上生長的黃萎病菌菌落，在試管中充分研磨后加入10 mL無菌水稀釋10倍，再利用梯度稀釋法依次稀釋至104倍。利用移液槍吸取500μL的最終稀釋液均勻涂布于MSN培養基平板上，重復5次。在25℃培養箱培養5d左右，待平板上長出黃萎病菌單菌落后，使用接種針將單菌落接種在PDA培養基中央，置于25℃相對濕度50%的培養箱內，培養7d，待菌落長滿平板后，觀察棉花黃萎病菌的生長形態特征。

1.5棉花黃萎病菌菌株落葉型與非落葉型檢測

挑取純化后的棉花黃萎病菌菌塊，接種于鋪有玻璃紙的PDA平板上，培養10～20 d后，刮取玻璃紙表面生長的菌絲至濾紙上進行烘干后，移至離心管中加入鋼珠和液氮，使用全自動樣品快速研磨儀研磨，再用天根新型植物基因組DNA提取試劑盒提取棉花黃萎病菌菌株的基因組DNA。

利用棉花黃萎病落葉型菌株特異性引物D1：5′-CATGTTGCTCTGTTGACTGG-3′，D2：5′-GA-CACGGTATCTTTGCTGAA-3′;非落葉型菌株特異性引物ND1： 5′-CAGGGGATACTGGTACG-AGACG-3′， ND2： 5′-ATGAGTATTGCCGATA-AGAACA-3′[13]，對棉花黃萎病菌進行PCR擴增，上述引物均由北京新時代眾合科技有限公司合成。

反應體系25μL：2×Taq PCR Green Mix 12.5μL，DNA模板1.0μL，上、下游引物各0.5μL，ddHO10.5μL。擴增程序：94℃預變性5 min; 94℃變性1 min，56。C退火1 min，72℃延伸3 min，35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀拍照。

1.6數據分析

利用Excel軟件對調查數據進行統計和作圖，并利用其中的Correl函數進行相關性分析。

2結果與分析

2.1北疆棉區棉花黃萎病發生情況

棉花黃萎病調查結果顯示，2021年北疆抽樣棉田中，無病田98塊，占調查棉田的49.2%；0%≤發病率<5.0%的棉田65塊，占32.7%；5%≤發病率<10%的棉田8塊，占4.0%；10%≤發病率<20%的棉田10塊，占5.0%；20%≤發病率<30%的棉田為10塊，占5.0%；發病率≥30%的棉田8塊，占4.0%。分析發現，北疆棉區棉田以無病田和發病率<5.0%的病田為主，共占81.9%。

與2013年[14]、2015年[15]同期調查結果（已另文發表）進行比較分析，2013年、2015年北疆無病棉田分別占31.6%和36.6%，而2021年無病棉田占49.3%，2021年無病田率分別較2013年、2015年增加17.7和12.7百分點。2013年、2015年發病率≥5%的棉田分別占33. 7%和39. 6%，而2021年發病率≥5%的棉田占18.0%，2021年發病率≥5%的棉田分別較2013年、2015年減少15.7和21.6百分點。北疆棉區發病嚴重棉田占比在2015年處于最高點，尤其發病率≥30%的嚴重棉田占比達11.2%.比2013年、2021年分別高111.3%、180.0%（圖1）。至2021年，北疆棉區無病田增多，嚴重發病田減少，棉田發病有所減輕。

2.2棉田發病情況與微菌核數量的相關分析

整體來看，北疆棉田黃萎病發病率與土壤中微菌核數量的線性方程為y=151.24x+3.4504，相關系數R=0.1191，相關性不顯著。分區域來看，呼圖壁一瑪納斯片區整體發病較輕（圖2），該片區7號棉田每克土壤（干重，下同）中微菌核數量最高，達63.7個，發病率為12.5%；11號棉田發病率為25.0%，但其每克土壤中微菌核數量為30.7個，低于7號棉田；8號棉田發病率為3.5%，每克土壤中微菌核數量為15.3個；9號棉田為零星發病田（發病率<0.1%），每克土壤中微菌核數量為3.7個。分析發現，呼圖壁-瑪納斯片區棉田黃萎病發病率與微菌核數量的相關系數為0.6357，兩者呈中度正相關。部分發病率低的棉田土壤中微菌核的數量反而比發病率高的棉田多，可能與種植品種的抗病性差異有關。

石河子一沙灣片區79、66、43號棉田土壤中微菌核數量較多，每克土壤中分別為120.0、100.3、46.7個，但是對應棉田的發病率較低，分別為5.0%、12.5%、0.5%。26、49、32號棉田為零星發病田，但是每克土壤中微菌核數量高達49.3、46.7、45.7個（圖3）；而71、62、57、27、56、81號棉田的發病率較高，分別為42.5%、40.0%、30.0%、25.0%、20.0%、15.0%，但是對應棉田土壤中微菌核的數量反而偏少，每克土壤中分別為30.3、21.0、15.7、2.7、16.7、16.0個。分析表明，石河子一沙灣片區棉田黃萎病發病率與土壤中微菌核數量的相關系數為0.0332，兩者無顯著相關，可能主要與種植品種的抗病性差異有關。

奎屯一烏蘇片區棉花黃萎病整體發生較輕（圖4）。96、139號棉田發病率較高，分別為22.5%、20.0%，每克土壤中微菌核數量分別為3.3、17個；118號棉田每克土壤中微菌核數量高達42個，而發病率卻僅為4.0%。分析表明，奎屯一烏蘇片區棉田黃萎病發病率與土壤中微菌核數量的相關系數為0.0076，兩者無顯著相關。

精河一博樂片區197、193、147號棉田發病率較高（圖5），分別為40.0%、30.0%、30.0%，每克土壤中微菌核數量分別為16.3、20.0、12.7個；而發病率相對較低的194、144、157號棉田發病率分別為25.0%、20.0%、9.0%，對應棉田每克土壤中微菌核數量較高，分別為51.3、28.0、43.7個。分析表明，精河一博樂片區棉田黃萎病發病率與土壤中微菌核數量的相關系數為0.0623，兩者無顯著相關。

2.3土壤中棉花黃萎病菌的生長類型

從不同區域棉田土壤中共分離到195株棉花黃萎病菌，按其產生微菌核數量的多少分為菌核型、中間型、菌絲型3種類型。菌核型菌株能產生大量黑色的微菌核，該類菌株有113株，占57.9%；中間型菌株氣生菌絲少，環邊緣均勻產生少量微菌核，該類菌株有37株，占18.9%；菌絲型菌株表面產生濃密的白色菌絲，長時間培養不產生微菌核，該類菌株有45株，占23.2%。北疆棉田土壤中棉花黃萎病菌以菌核型為主。

2.4土壤中黃萎病菌菌株落葉型與非落葉型檢測

兩組特異性引物檢測結果顯示（圖7），利用落葉型特異引物D1／D2從195株棉花黃萎病菌中擴增到190株含有550bp的落葉型特異性條帶，判定為落葉型菌株，占97.4%，利用非落葉型引物NDl/ND2僅擴增到5株黃萎病菌含有1500 bp的非落葉型特異性條帶，判定為非落葉型菌株，占2.6%。檢測結果表明，目前北疆棉田土壤中的棉花黃萎病菌以落葉型菌株占絕對優勢。

3結論與討論

棉花黃萎病是現階段嚴重威脅新疆棉花生產安全的首要病害。2021年調查發現，北疆棉區棉田以無病田與零星病田為主，與2013、2015年同期相比，無病田與零星病田比例增多，嚴重發病棉田大幅減少。北疆棉區發病嚴重棉田在2015年處于高點，至2021年棉田發病減輕，可能與近年來大力推廣種植抗病棉花品種有關，因此在傳統植棉區棉花黃萎病發病嚴重區域應加大抗病棉花品種的研發與推廣工作。

土壤中的微菌核是棉花黃萎病的主要侵染源，其數量與棉花黃萎病發生嚴重程度呈正比[16]，土壤中的微菌核數量隨著棉花連作年限的延長而增加[17]，而種植感病棉花品種能促進微菌核迅速增長[18]。微菌核在土壤中主要呈聚集分布，主要分布在0～20 cm的耕層中[19]，占0～40 cm耕層中總量的79.9%，其中0～10 cm耕層中微菌核數量最多[20]，在土壤中能存活10年之久[21]。但2021年調查發現，整體上北疆棉區棉田黃萎病發病率與土壤中微菌核數量無顯著相關，分區域來看，呼圖壁一瑪納斯片區棉田發病率與土壤微菌核數量呈中度正相關，而石河子-沙灣片區、奎屯-烏蘇片區、精河-博樂片區棉田發病率與土壤微菌核數量均無明顯相關。推測出現這種現象的原因主要與種植棉花品種抗病性以及土壤中棉花黃萎病菌致病力有關，當區域種植的棉花品種抗病性一致、病原菌致病力一致的情況下，棉田黃萎病發生程度與土壤中微菌核數量呈正相關，但是當重病田改種抗病品種時，使得原本的重病田發病率降低，導致棉田土壤微菌核數量與發病率的相關性不顯著。另外，棉田采集的土壤樣本數量偏少及土壤中微菌核的區域分布差異，亦可能對分析結果產生影響，需加強該方面的監測研究工作。

李國英等[22]的研究表明，新疆棉株中分離到的黃萎病菌以菌核型為主，中間型和菌絲型菌株為輔。但是，袁洪波等[23]發現石河子棉區棉株中分離到的黃萎病菌以菌絲型為主，占60%；而惠慧等[24]研究發現北疆棉區棉株中分離到的黃萎病菌均為菌核型，后兩者的研究結果差異較大，充分表明新疆不同棉區的棉花黃萎病菌存在明顯的形態差異，多樣性豐富。本文發現，目前北疆棉區土壤中分離到的棉花黃萎病菌以菌核型為主。大麗輪枝菌種群復雜，具有落葉型／非落葉型、不同營養親和群、交配型等種群結構。其中，落葉性狀是大麗輪枝菌種群演化的重要類型，落葉型菌株的致病力明顯高于非落葉型[25]。新疆棉區2004年發現少量落葉型菌株[26]，2006年時落葉型菌株占8.6%[9]，至2008年—2013年新疆落葉型菌株已占30%以上[25，27]，2017年北疆棉區落葉型菌株已占76.5%[19]，2019年蔡夢杭等從北疆棉田病株上分離到的644株大麗輪枝菌中67.5%為落葉型菌株[28]，徐燦等[11]采集的208份土壤樣品中檢測到含有落葉型菌株的占98.6%。至2021年惠慧等發現南疆棉區、北疆棉區及東疆棉區中落葉型菌株分別達到82.14%、53.33%和100%[10]。本文發現，從土壤中分離到的195株棉花黃萎病菌中落葉型菌株占97.6%，與徐燦等[11]的研究結果較為一致。研究表明，隨著種植棉花年限的延長，目前北疆棉田土壤中黃萎病菌落葉型菌株占絕對優勢。

綜合來看，2021年北疆棉區棉花黃萎病發生較2015年減輕，土壤中棉花黃萎病菌生長類型以菌核型為主，落葉型菌株占絕對優勢，但田間發病棉株未表現出葉片嚴重脫落癥狀，可能是抗病棉花品種的大力推廣種植增強了棉花抵御黃萎病危害的能力。