基于原噬菌體類型的廣西柑橘黃龍病菌種群分析

李戰彪　林林　陳錦清等

關鍵詞 廣西；柑橘；柑橘黃龍??；原噬菌體；種群類型

中圖分類號：S 436.66 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022200

柑橘黃龍病（citrus Huanglongbing，HLB）是柑橘生產上的毀滅性病害，嚴重影響柑橘產業的健康發展[1]。該病由專性寄生的柑橘韌皮部桿菌屬Candidatus Liberibacter引起，目前發現有3個種，分別為亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）、非洲種Candidatus Liberibacter africanus（CLaf）和美洲種Candidatus Liberibacter america-nus （CLam）[1-2]，危害我國柑橘的主要為CLas。在我國HLB最早于20世紀50年代發現于廣東省，至今我國的大多數柑橘產區都受到該病的危害，且部分地區受害嚴重[1，3-6]。廣西是我國重要的柑橘產區，柑橘種植面積和產量均居全國前列，黃龍病的肆虐嚴重制約產業的發展。明確黃龍病在廣西的發生、分布并分析黃龍病菌種群類型，對掌握該病的蔓延流行及防控有重要意義。

針對CLas種群多樣性的研究大多基于保守的16S rDNA序列、16S/23S rRNA基因間隔區、β操縱子以及外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）基因等染色體區域[7-9]。Subandiyah等[9]通過16S rDNA、16S/23S rDNA間隔區對亞洲多個地區的黃龍病菌進行分析發現其基因變異較小，多樣性不顯著；謝昌平等[7]對贛南柑橘黃龍病菌的16SrDNA、16S/23S rDNA間隔區和核糖體蛋白基因的遺傳多樣性進行分析發現，供試的黃龍病菌樣品在3個基因片段上的RFLP指紋圖譜均一致，未表現出多態性[7]；黃永輝等[10]OMP基因對廣東不同地區的柑橘黃龍病菌遺傳多樣性進行分析未發現顯著差異。Puttamuk等[11]利用2個效應因子基因（LasA和LasA）對泰國的柑橘黃龍病菌進行多樣性分析發現，LasAn基因的突變率較小。相對于保守的染色體區域，原噬菌體區域由于是噬菌體整合到細菌宿主基因組的DNA片段，具有較高的隨機性和變異率，更適于研究CLas種群遺傳結構多樣性。Tomimura等[12]對東南亞各國不同寄主、不同來源的柑橘黃龍病菌的變異水平研究后發現，相比16S rDNA、16S/23S rDNA間隔區，原噬菌體DNA聚合酶基因更能區分不同國家CLas間的差異；Liu等[13]則通過原噬菌體末端酶基因對我國云南和廣東的HLB樣品進行分析，發現兩省樣品中的原噬菌體末端酶基因檢出率存在差異；Zhou等[14]利用2個原噬菌體超變異基因對不同地區、不同品種的CLas進行研究，發現不同來源的菌株在該基因上具有高度多態性；黃洪霞等[15]利用原噬菌體區域和短串聯重復序列（short tandem repeats，STR）對采自廣東省的176個黃龍病樣品進行了分析，結果表明基于不同位點和基于所有位點所得到的聚類不同；Fu等[16]對我國南方9省的CLas的原噬菌體類型進行分析發現，南方9省的CLas可根據海拔位置分為兩個組群，高海拔的PTG1和低海拔的PTG2，而PTG2又進一步分為PTG2-1和PTG2-2，廣西的菌群位于PTG2-2：Zheng等[17]利用原噬菌體、短串聯重復序列和微型反向重復轉座元件（miniature in-verted-repeat transposable elements， MITEs）對我國南方9省的667份CLas分析后發現，不同基因位點呈現的CLas的遺傳多樣性存在差異。目前，已鑒定到3種類型的原噬菌體type l（SC1，NC_019549）、type 2（SC2， NC_019550）和type 3（P-JXGC-3，KY661963），且不同的CLas菌株可能攜帶不同類型或組合的原噬菌體[18-21]。

廣西地處熱帶亞熱帶地區，氣候適宜柑橘類作物生產，也是黃龍病發生較為嚴重的地區；針對廣西柑橘黃龍病的研究多集中在某一品種[22]或不同品種間[23]的黃龍病發病率及16S rDNA的分析上，較少有系統研究其種群的報道。近些年，隨著柑橘產業迅速擴張，黃龍病、病毒病等病害呈高發趨勢，研究病原菌的種群分化有助于了解病害的發生與流行，進而制定更為有效的防控措施。本研究從廣西各地市柑橘種植區采集疑似柑橘黃龍病樣品，并對樣品進行黃龍病菌和原噬菌體類型的PCR檢測，明確HLB在廣西的發生分布及黃龍病菌的種群類型，研究結果將為該病的防控提供理論支撐。

1材料與方法

1.1柑橘葉片樣品采集

2016年-2021年，從廣西壯族自治區南寧市、柳州市、百色市、梧州市等14個地級市的柑橘種植區，采集‘沃柑’‘砂糖橘’‘沙田柚’‘臍橙’‘貢柑’‘黃金柑’‘茂谷柑’‘皇帝柑’‘三紅蜜柚’‘脆蜜金橘’‘泰國紅寶石青柚’‘越南青柚’等品種疑似黃龍病葉片樣品3 293份，保存于-80℃備用。

1.2 DNA提取

取葉片樣品100 mg，用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]抽提葉片總DNA。具體操作參照試劑盒說明書進行。最后將DNA沉淀溶解于50μL ddHO中，-20℃保存備用。

1.3黃龍病菌的PCR檢測

黃龍病菌的PCR檢測引物參考Hocquellet等[24]報道的基于β操縱子基因設計的檢測引物（表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。反應體系如下（總體積20μL）：DNA1μL，10μmol／L上、下游引物各0.5μL，2×TaqMasterMix（Dye）（康為世紀生物科技有限公司）10μL，ddH20 8μL。PCR反應程序：95℃ 5 min;95℃30 s，540C 30 s.72℃30 s，35個循環；72℃10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4基于原噬菌體類型的黃龍病菌檢測

黃龍病菌分型引物參考Zheng等[25-26]（表1），引物序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。選取2021年PCR檢測為陽性的柑橘葉片總DNA為模板，反應體系如下（總體積10μL）：DNA0.5μL，10μmol／L上、下游引物各0.5μL，2×TaqMaster Mix （Dye）（康為世紀生物科技有限公司）5μL，ddHO 3.5μL。PCR反應程序：95℃ 5 min;95℃30 s，54℃45 s，72℃45 s，35個循環；72℃10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1柑橘樣品的PCR檢測

利用黃龍病菌特異檢測引物對所采集的葉片總DNA進行PCR檢測，結果發現，所采集的3293份柑橘葉片樣品中有856份樣品可擴增出一條大小約為703 bp的目的條帶（圖1），而健康柑橘樣品對照和清水對照則無相應擴增，陽性樣品檢出率為25. 99%。分別對每年、每個地市樣品的檢出率進行分析，發現廣西壯族自治區內的14個地市均有黃龍病發生，其中，691份樣品采集自南寧市，黃龍病陽性樣品的檢出率為33.29%；同時，通過對2016年一2021年每年的樣品檢出率進行統計發現，自2016年起，廣西各地市黃龍病的檢出率呈上升趨勢（表2）。

2.2廣西柑橘黃龍病菌攜帶的原噬菌體類型

本研究利用Zheng等[24-25]報道的引物對2021年采集的268份陽性柑橘樣品進行了檢測，從部分樣品中可分別或同時擴增出type 1（目的條帶分別為975 bp和866 bp）、type 2（目的條帶分別為813 bp和918 bp）、type 3（目的條帶分別為950 bp和884 bp）等3種類型的目的PCR條帶（圖2）。

統計檢測結果發現，在268份樣品中，67.91%的樣品僅能擴增出1種噬菌體類型的目的條帶，5.97%的樣品可同時擴增出2種或2種以上噬菌體類型的目的條帶，部分樣品未能擴增出任何噬菌體類型的目的條帶。共計存在7種類型的黃龍病菌種群（表3），即僅有type 1菌株，僅有type 2菌株，僅有type 3菌株，type 1+type 2復合菌株，type 2+type 3復合菌株，type 1+type 2+type 3復合菌株，未檢出任何類型菌株（none type）；而在這些僅能擴增出一種噬菌體類型的樣品中，170份樣品能擴增出type 2，表明type 2是廣西的優勢種群；僅含有type 1和僅含有type 3的菌群只在南寧市發現；復合菌群主要以type 1+type 2（3個），type 2+type 3（2個），type 1+type 2+type 3（11個）3種組合存在，本研究未檢測到type 1+type 3類型組合的菌群。其中，南寧市的CLas種群類型最為豐富（表3）。

3結論與討論

近年來，隨著我國柑橘產業的高速發展，廣西柑橘種植面積和產量居全國之首，柑橘黃龍病給柑橘產業帶來了極大威脅。本研究利用常規PCR對從廣西各地級市采集的3293份柑橘（柚類）樣品進行了檢測，結果發現有856份樣品感染了柑橘黃龍病，陽性樣品檢出率為25.99%，通過對各市陽性樣品進行統計發現，各地市的柑橘樣品均能檢出柑橘黃龍?。欢ㄟ^對不同年份的黃龍病檢出率進行統計發現，2016年—2021年，黃龍病菌的檢出率從12.16%逐步上升至46.94%，研究結果顯示，柑橘黃龍病在廣西的發生有加重的趨勢，防控形勢不容樂觀。

原噬菌體區域具有較高的隨機性和變異率，適于研究CLas種群遺傳結構多樣性，目前，已鑒定到3種類型的原噬菌體type l（SC1，NC_019549）、type 2（SC2，NC_019550）和type 3（P-JXGC-3，KY661963）[19，27]。在我國，存在多種類型的原噬菌體CLas菌株，陳麗芬等[28]在贛南地區的柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama體內發現4種組合的原噬菌體類型菌株，且單一類型的菌株檢出率較高；李嘉慧等[21]在我國南方8省區發現7種組合的原噬菌體菌株，type 2類型的檢出率最高，是華南地區CLas的優勢菌株；崔一平等[20]對廣東梅州柑橘主產區CLas的噬菌體類型研究發現，梅州柑橘主產區的CLas大部分含有SC2-1。本研究利用3種類型的原噬菌體分類的特異性引物對廣西壯族自治區內CLas的種群類型進行了分析，結果顯示，廣西區內存在7種類型的CLas菌株，其中，type 2類型的菌株檢出率達63.06%，是廣西的優勢菌株，該結果與李嘉慧等[21]的部分研究結果一致；不同的是，本研究還發現了type 1、type 2+type 3和type 1+type2等3種類型的菌株，但并未發現李嘉慧等報道的type 1+type 3菌株，這可能跟采樣地點不同有關。另外，值得注意的是，本研究有較大比例（26.49%）的黃龍病陽性樣品中未檢出任何類型（none type）的原噬菌體菌株，是位點發生變異還是存在其他類型的原噬菌體菌株，值得深入研究。

基因交流和選擇壓力是促進種群進化的主要原因。本研究發現廣西區內CLas原噬菌體菌株類型多樣（7種類型）。近年來廣西柑橘產業的迅猛發展，新品種不斷引進并大力推廣，區域間種苗調運頻繁，而苗木帶菌則促進了基因交流，不同品種間的選擇壓力促使種群進化。本研究未能就不同地域間的不同品種上的CLas種群進行研究，但崔一平等[20]研究認為CLas的進化與柑橘品種、小范圍內的地域關系不大，但其也發現CLas菌株的進化速度較快，在同一地域的同一果園內存在不同的CLas株系。研究CLas在同一區域不同品種間的進化有助于了解黃龍病的發生流行規律，相關研究仍待進一步加強。

本研究通過6年的采樣鑒定發現，柑橘黃龍病已遍布廣西各地市，病菌種群結構多樣，且類型較為復雜，黃龍病在廣西的種群進化等還有待進一步研究。