連續炭基肥替代化肥對菜園土壤性質和細菌群落結構的影響

葉菁, 王義祥,2*, 劉岑薇, 林怡, 黃家慶, 翁伯琦

連續炭基肥替代化肥對菜園土壤性質和細菌群落結構的影響

葉菁1, 王義祥1,2*, 劉岑薇1, 林怡1, 黃家慶1, 翁伯琦1

(1. 福建省農業科學院農業生態研究所, 福建省紅壤山地農業生態過程重點實驗室，福州 350013；2. 福建省農業科學院土壤肥料研究所，福州 350013)

為了解生物炭基肥替代化肥減量施用的田間長期效應，利用定位試驗研究連續5 a炭基肥替代化肥對蔬菜產量、土壤理化性質和細菌群落結構的影響。結果表明，連續5 a實施炭基有機肥替代化肥，土壤pH提高了0.13～0.25，土壤有機質、堿解氮和有效磷含量也分別提高了2.1%～62.2%、5.8%～86.0%和0.4%～103.1%，炭基肥替代化肥處理的薺菜()產量提高了4.0%～14.8%，但75%替代處理較50%替代處理有所降低。炭基肥替代化肥處理的土壤菌群Sobs、Shannon、Ace和Chao指數均高于單施化肥處理，且均以75%替代處理最高。炭基肥替代化肥顯著降低了土壤中硝化菌屬()、擬無枝酸菌屬()、芽單胞菌屬()等的豐度，增加了纖維素降解菌菌群(、)的豐度。芽單胞菌屬、Ilumatobacteraceae、Methyloligellaceae等的豐度與土壤全氮、全磷、有機質間具有顯著的相關性。可見，連續炭基肥替代化肥明顯改善了菜地土壤的理化性質，從而影響了土壤細菌群落結構和多樣性，適量替代可以提高蔬菜產量，但應注意長期連續施用對土壤pH、碳/氮的影響，避免過量施用抑制作物對養分的吸收利用。

菜園；生物炭基肥；化肥；土壤；細菌群落

我國是化肥生產和使用大國，2019年我國農用化肥施用折純量為5.404×107t。近年來隨著化肥減量增效政策的實施，我國化肥施用總量首次呈現略微降低的態勢，但與發達國家相比仍存在較大的差距。尤其是對蔬菜作為高耗肥農作物，1997—2018年我國蔬菜平均化肥施用量為602.6 kg/hm2，是主糧作物的1.8倍[1]。在“雙碳”目標下，為保障蔬菜生產，改善施肥種類以減少化肥使用和提高養分利用率是現代蔬菜產業發展亟需解決的重要問題。

生物炭基肥作為一種新型肥料，通過改善土壤理化性質、調節土壤微生物活性，有利于提高植物對養分的利用效率以及減少土壤中養分流失，近年來備受農業與環保領域的廣泛關注和研究應用[2]。生物炭基肥的類型有炭基無機肥、炭基有機肥、炭基復混肥等，可用于大田作物水稻()、玉米()、小麥()以及設施蔬菜等，作物應用上總體表現為正調控效應，具有增產提質、節肥增效及固碳減排等作用[3]，但目前多數生物炭基肥的研究中應用年限相對較短，其田間應用評價仍亟待加強[4]。生物炭基肥對作物生長、土壤改良效果與其種類、組成成分、土壤類型等因素有關，需進一步研究[5–6]。微生物在土壤養分循環、有機質分解以及土壤結構形成和穩定性方面發揮重要作用[7]，其多樣性指數的變化也是反映土壤健康狀態的敏感指標[8]。有研究表明，生物炭施用提高了土壤pH和養分利用水平[9]，生物炭的多孔性結構可為微生物提供適宜的生存環境[10]，還可通過吸附養分或改良土壤性質間接影響微生物群落[11],但生物炭自身養分有限，不能滿足作物生長的需要[12]。炭基有機肥可以發揮生物炭和有機肥的互補或協同作用，有利于提高肥效和彌補生物炭養分不足[13]，因此，本文研究生物炭基肥替代化肥減量施用對菜園土壤性質和細菌群落結構的影響，旨為蔬菜生產中科學應用生物炭基肥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗地位于福建省福清市漁溪鎮(25°25′ N, 119°36′ E)，屬亞熱帶海洋氣候，年均溫18.8 ℃, 年均無霜期365 d，年降水量1 350～1 500 mm。土壤為黏質土，有機質含量1.37%，全氮、全磷和全鉀含量分別為0.09%、0.06%和2.51%，堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為42.0、35.2和193.04 mg/kg, pH值6.85。試驗用生物炭由花生殼在500 ℃下裂解制備，其有機碳、全氮、全磷和全鉀含量分別為566.1、10.2、2.5和4.7 g/kg，pH值9.31。炭基有機肥由花生殼生物炭、腐熟有機肥復配而成，其中生物炭、氮、P2O5和K2O的質量分數分別為9%、1.4%、3.4%和1.8%，pH 7.8。

1.2 試驗設計

田間試驗采用單因素隨機裂區設計，共設4個處理，即炭基肥替代化肥氮量分別為0 (HF)、25% (B1)、50% (B2)和75% (B3)，每處理3個小區重復，小區面積為8 m2。各處理等氮量設計，氮素施用量為180 kg/hm2。化肥分別為尿素、過磷酸鈣和氯化鉀。HF處理的化肥用量分別為尿素390 kg/hm2、過磷酸鈣750 kg/hm2、氯化鉀220 kg/hm2。B1、B2和B3處理分別利用相應量的炭基有機肥替代尿素氮,磷、鉀不足部分用過磷酸鈣和硫酸鉀補足。試驗開始于2017年3月下旬，每年種植蔬菜兩茬, 第一茬(3月—7月)種植葉用甘薯()，第二茬(9月—次年1月)種植薺菜(), 每茬施肥1次。

1.3 蔬菜產量測定

于2021年1月，采收每個小區全部當季種植的薺菜，稱取質量進行產量測定。

1.4 土壤采集和理化性質分析

連續5 a炭基肥替代化肥后，于2021年4月在各試驗小區內以“S”型多點混合法采集0～20 cm土樣，去除植物碎屑和碎石，混合樣品后放于冷藏箱內帶回實驗室。

pH采用pH計以水土比2.5:1浸提測定，全氮含量采用凱氏定氮儀測定，有機質含量采用重鉻酸鉀和硫酸亞鐵滴定法，堿解氮含量采用堿解擴散- H3BO3吸收滴定法；全磷和速效磷采用鉬銻抗比色法，全鉀采用火焰光度法測定[14–15]。

1.5 土壤菌群結構分析

采用土壤DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek Inc, Doravilla, GA, USA)提取菜園土壤細菌的總DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，然后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，以Illumina MiSeq平臺進行高通量測序和分析。

1.6 數據處理

數據分析基于上海美吉生物醫藥科技有限公司提供的云服務(https://www.i-sanger.com)進行。參照王義祥等[16]的方法，分析前以“按最小樣本序列數”進行數據抽平處理，其中多樣性指數(-diversity)利用mothur version v.1.30.1 (http://www.mothur.org/)計算；Qiime計算采用-多樣性距離矩陣，以R語言作圖；相關性Heatmap圖的軟件及算法采用R語言pheatmap package提供的方法。數據組間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和克氏秩和檢驗(Kruskal-Wallis H test)。菌群結構關聯與模型預測采用Network共現性網絡分析和單因素相關性網絡分析進行分析。環境因子關聯分析采用歐氏距離法。基于Spearman等級相關系數制作了豐度前50屬與環境因子的相關性Heatmap圖[17]。

2 結果和分析

2.1 薺菜產量的變化

HF、B1、B2和B3處理的薺菜產量分別為27.93、29.06、32.07和30.94kg/hm2。炭基有機肥替代處理較單施化肥處理(HF)均不同程度提高了薺菜產量, 為4.0%～14.8%，其中以B2處理的增幅最大, 且B2處理顯著高于HF處理(<0.05)，但HF、B1和B3處理間的差異均不顯著(>0.05)。B2處理比B3處理高3.7%，但兩者間的差異不顯著(>0.05)。

2.2 土壤理化性質的變化

連續施用炭基肥5 a后，菜園土壤的pH值比單施化肥處理提高了0.13～0.25，其中B1和B2處理與HF處理間的差異達顯著水平(<0.05)。從表1可見,隨著炭基肥替代量的增加，土壤中全氮、有機質、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷、速效鉀含量呈上升趨勢, 其中土壤有機質含量增加了2.1%～62.2%，全氮增加了13.3%～48.9%，堿解氮含量提高了5.8%～86.0%, 有效磷含量提高了0.4%～103.1%，B2和B3處理與HF間的差異均達顯著水平(<0.05)，HF與B1處理間的差異不顯著；但各處理間的全鉀含量變化不大。

表1 土壤的理化性質

HF、B1、B2、B3分別表示炭基肥替代化肥氮量為0、25%、50%、75%；同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(<0.05)。下同

HF, B1, B2 and B3 represent 0, 25%, 50% and 75% nitrogen replacement of biochar-based fertilizer, respectively. Data followed different letters within column indicate significant differences at 0.05 level. The same below

2.3 土壤菌群多樣性的分析

多樣性分析結果表明(表2)，土壤菌群的Sobs、Shannon、Ace和Chao指數均以B3處理最高，且各指數均為B3>B2>B1>HF。Simpson指數以B1處理最高，且B1與B2、B3處理間的差異均達顯著水平(<0.05)。覆蓋度以HF處理最高，且與B3處理間的差異達顯著水平(<0.05)。

對于-多樣性，基于Bray-Curtis距離的PCoA分析表明，施肥處理顯著影響了土壤菌群的分布(PERMANOVA,<0.05)。施肥處理能夠解釋菌群組成總體差異的29.1% (圖1: A)。根據炭基肥中生物炭的用量對樣本進行分組，炭基肥中生物炭的用量對解釋菌群組成總體差異的34.0% (圖1: B)。

2.4 土壤菌群的物種組成分析

在門水平上(圖2: A)，各處理土壤中主要的優勢菌有放線菌門(Actinobacteriota)、變形桿菌門(Proteo- bacteria)、厚壁菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acido- bacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacte- roidota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、Myxoco- ccota和Patescibacteria，其中放線菌門、變形桿菌門、厚壁菌門、酸桿菌門的豐度占80.7%以上。B2與B3處理的放線菌門相對豐度較HF處理分別降低了17.4%和15.3%，而酸桿菌門、厚壁菌門和Myxoco- ccota的相對豐度分別提高了61.5%和38.4%、40.4%和48.4%、20.0%和34.9%。

表2 土壤細菌的物種豐富度和多樣性指數的變化

圖1 土壤菌群的PCoA+Adonis分析。A: 施肥處理; B: 生物炭用量。

在屬水平上，所有土壤樣品中共注釋到790屬(圖3: A), 各處理包含菌屬的排序為B3>B2>B1>HF。其中4個處理的共有菌有517屬，HF處理獨有的20屬，B1為16屬，B2為18屬，B3為31屬。諾卡氏菌屬(, 5.33%～8.66%)、鞘氨醇單胞菌屬(, 4.04%～7.42%)、JG30-KF-CM45 (3.35%～6.00%)均是主要的優勢菌屬。除此之外, HF處理的優勢菌屬還有(3.35%)、大理石雕菌屬(, 2.86%)和鏈霉菌屬(, 2.77%)等(圖3: B); B1處理的還有節桿菌屬(, 3.24%)、Roseiflexaceae(3.13%)和KD4-96 (2.96%)。B2和B3處理的還有蓋勒氏菌屬(Gaiella, 2.94%～2.98%) (圖2: B)。HF和B1處理豐度最高的菌屬為諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和JG30-KF-CM45；B2處理豐度最高的為諾卡氏菌屬、JG30-KF-CM45B3和KD4-96；B3處理為諾卡氏菌屬、和鞘氨醇單胞菌屬。在屬水平上的單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey- Kramer檢驗表明，4個處理間的硝化菌屬()、薄壁芽孢桿菌屬()、擬無枝酸菌屬()、、、、JG30-KF-CM45和的豐度存在顯著差異(<0.05)，而芽單胞菌屬()和的豐度存在極顯著差異(<0.01)。

圖3 基于屬水平的菌群的venn圖(A)和共有物種組成餅圖(B)

2.5 土壤菌群結構關聯與模型預測分析

共現性網絡分析表明，屬水平上所有物種共有2 643個有效節點(圖4: A)，HF、B1、B2和B3處理分別有617、655、686和685個節點。與4個處理均共線的屬約有55.3%，至少有75.4%的屬在2組以上的處理中共線。4個處理中有11屬的共線率超過2%, 其中(6.93%)、(5.99%)、JG30-KF-CM45 (4.99%)、(4.62%)、(2.86%)、Vicinamibacteraceae (2.84%)、Rosei- flexaceae(2.55%)、(2.42%)和(2.23%)；有9屬共線率超過1%，其中(1.71%)、(1.58%)、Gemmati- monadaceae (1.46%)、(1.23%)和(1.01%)。以上20屬確定為菜地土壤細菌群落的核心菌群。相關性網絡分析表明(圖4: B)，網絡中顯示有19個節點和111條邊，說明土壤菌群存在較高的連接性。Latescibacterota、Armatimonadota、Deinococcota、Acidobacteriota、Dadabacteria、NB1-j、Nitrospirota、Entotheonellaeota、RCP2-54、Myxoco- ccota等門的相關性較大，在整個菌群網絡中起關鍵作用，其中Deinococcota與其他門呈負相關。

2.6 與環境因子的關聯分析

環境因子對菌群結構影響的RDA分析表明, RDA1軸和RDA2軸對菌群結構差異的解釋度分別為36.63%和16.69%。較高炭基肥替代量的B2和B3處理與HF和B1處理在RDA1軸方向上被分離開(圖5: A)。Heatmap相關性分析表明(圖5: B),的豐度與土壤pH、全氮、全磷、有機質、速效磷、速效鉀、銨態氮間均具有顯著的相關性(<0.05);、Ilumatobacteraceae、Methyloligellaceae的豐度與土壤全氮、有機質和全磷含量有顯著相關性(<0.05)；、、、、Xanthobacteraceae的豐度與土壤有機質含量具有顯著的相關性(<0.05); Xanthobacter- aceae、、、、Roseiflexaceae、、Vicinamibacteraceae的豐度與土壤全磷含量有顯著相關性(<0.05); 但大多數菌屬與土壤全鉀含量無顯著相關性(>0.05)。

圖4 共現性網絡(A)和相關性網絡圖(B)

圖5 土壤菌群結構與環境因子的冗余分析(A)和相關性分析(B)。TN: 全氮; SOM: 有機質; AN: 堿解氮; AP: 有效磷; AK: 速效鉀; TP: 全磷; TK: 全鉀。

3 結論和討論

炭基肥替代化肥連續施用5 a后，土壤理化性質發生了較大變化, 菜地土壤pH提高了0.13～0.25，土壤有機質含量增加了2.1%～62.2%，且土壤中的堿解氮、有效磷和速效鉀等速效養分含量的增幅高于全量養分含量的增幅，這可能是炭基肥有機肥中生物炭等具有大的表面積與良好的介孔結構，可吸附固定養分以降低土壤氮磷鉀的流失[18]。生物炭基肥也能夠抑制硝化細菌[19]、氨氧化變形桿菌[20]的活性，從而影響氮的硝化循環，降低氮素的損失。也有研究表明，生物炭基肥可提高土壤中磷溶解細菌、鉀溶解細菌的活性，從而顯著增加土壤中速效磷和速效鉀的含量[2,21]。從對薺菜產量的影響來看，炭基肥替代化肥處理的薺菜產量均有不同程度的提高，但隨著替代量的增加薺菜產量逐漸下降，這可能是因為薺菜適宜生長的土壤為微酸性或中性, 連續5 a的炭基肥施用導致土壤pH不斷升高，而土壤過酸或過堿都不利于提高養分的生物有效性[22]。已有研究表明，土壤中C、N、P化學計量比決定著植物、微生物的養分可利用性，土壤C/N又是影響微生物活動導致土壤養分有效性變化的關鍵因素[23]。本試驗初始時的土壤C/N相對較低，可供微生物利用的碳源較少，微生物活性降低，從而影響養分的有效性，進而不利于植物的生長發育[24]，但隨著炭基肥投入量的逐年累積，土壤C/N增大。當土壤C/N較高時，土壤微生物的繁殖要消耗一部分氮素，出現微生物與植物共同競爭土壤氮素，進而影響植物的生長[25]。因此，炭基肥連續施用應注意土壤類型以及對土壤pH、C/N的影響，避免過量施用抑制作物對養分的吸收利用。

土壤微生物群落與土壤理化性質關系密切，如土壤養分、pH、C/N等的改變都可能引起群落結構的變化。本研究結果表明，相對單施化肥處理，不同炭基肥處理的土壤菌群的Sobs、Shannon、Ace和Chao指數均有不同程度的提高；施肥處理顯著影響了土壤菌群的分布，且能夠單獨解釋菌群組成總體差異的29.1%，炭基肥中生物炭用量對解釋菌群組成總體差異的34.0%。環境因子的關聯分析表明，芽單胞菌屬、Ilumatobacteraceae、Methyloligellaceae等與土壤全氮、全磷、有機質含量間具有顯著的相關性，但與土壤全鉀含量間無顯著相關性。碳、氮和磷是微生物生長繁殖必需的營養物質，除了炭基肥中所含生物炭為微生物提供良好的棲息場所外，炭基肥是以生物炭與有機肥料配比制得，含有豐富的C、N、P等營養成分，能夠直接為微生物生長提供所需的養分[26]。從土壤菌群結構來看，放線菌門、變形桿菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門等是土壤中主要的優勢菌門；諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬是主要的優勢菌屬。共現性網絡分析表明，諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、是本研究菜地土壤最為核心的菌群。已有研究表明，諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬中一些菌株對土壤除草劑具有生物降解作用[27–28]；還可促進植物抵抗多種植物病原菌，如對引起黃萎病的真菌有拮抗作用[29]。從菌群的物種組成來看，相較于單施化肥處理，炭基肥處理顯著降低了土壤中硝化菌屬、擬無枝酸菌屬、芽單胞菌屬、盧德曼氏菌屬、的豐度，增加了薄壁芽孢桿菌屬、扁平絲菌蘇黎世桿菌屬、的豐度。硝化菌屬是土壤氮素轉化的功能菌群之一，主要是參與把亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽的過程[30]。炭基肥的施用通過改變土壤性狀和影響土壤中氮素轉化，直接或間接地影響了硝化菌屬的相對豐度[16]。本研究結果還表明，隨著炭基肥替代量的增大，土壤中纖維素降解菌群(如、[31])的豐度呈升高的趨勢，而嗜酸性菌群(如、)[32]的豐度則降低。

綜上，炭基肥引發土壤性狀改變(土壤pH、全氮、全磷、有機質含量提高)，進而導致土壤菌群結構和多樣性發生變化，改善了土壤微生物生態，本研究為炭基肥應用于菜園土壤培肥改良提供了重要的科學參考。

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Effects of Continuous Biochar-based Fertilizer Replacement on Soil Properties and Bacterial Community Structure in Vegetable Garden

YE Jing1, WANG Yixiang1,2*, LIU Cenwei1, LIN Yi1, HUANG Jiaqing1, WENG Boqi1

(1. Agricultural Ecology Institute, Fujian Academy of Agricultural Science, Fujian Key Laboratory of Agricultural Ecological Process of Red Soil Mountain, Fuzhou 350013, China; 2. Institute of Soil and Fertilizer,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou 350013, China)

In order to understand the field long-term effect of biochar-based fertilizer instead of chemical fertilizer, the vegetable yield, soil physical and chemical properties and bacterial community structure with biochar-based fertilizer replacement for 5 consecutive years were studied by localization experiment. The results showed that soil pH increased 0.13-0.25 after 5 years, and the contents of organic matter, alkali-hydrolyzable nitrogen and available phosphorus in soils increased 2.1%-62.2%, 5.8%-86.0% and 0.4%-103.1%, respectively. The yield ofwith biochar-based fertilizersincreased by 4.0%-14.8% than that of the control, but the yield under 75% replacement was lower than that of 50% replacement. The indexes of Sobs, Shannon, Ace and Chao of soil bacteria with biochar-based fertilizer were higher than those of chemical fertilizer, and those under 75% replacement were the highest. Compared to chemical fertilizer, the abundances ofandwith biochar-based fertilizer decreased significantly, and the abundances of cellulose-degrading bacterial increased, such asand. There were significant correlations between the abundances ofIlumatobacteraceae, Methyloligellaceae, and soil total nitrogen, total phosphorus, organic matter. Therefore, the replacement of continuous biochar-based fertilizer significantly improved soil physical and chemical properties, and caused the changes in bacterial community structure and diversity. Appropriate replacement of biochar-based fertilizers could increase vegetable yield, but the effect of long-term continuous application on soil pH and C/N should be paid attentions, so as to avoid excessive application inhibiting nutrients uptake and utilization by crops.

Vegetable garden; Biochar-based fertilizer; Chemical fertilizer; Soil; Bacterial community

10.11926/jtsb.4624

2022-02-04

2022-05-27

中央引導地方科技發展專項(2021L3021)；福建省科技廳公益項目(2020R1021003)；福建省農科院協同創新工程(XTCXGC2021010)資助

This work was supported by the Project for Central Government Guides Local Science and Technology Development (Grant No. 2021L3021), the Project for Public Welfare Scientific Research in Fujian (Grant No. 2020R1021003), and the Project for Collaborative Innovation of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. XTCXGC2021010).

葉菁(1985年生)，女，助理研究員，研究方向為紅壤保育與生態修復。E-mail: anna_0266@163.com

通訊作者 Corresponding author.E-mail: sd_wolong@163.com