禮泉醪糟微生物多樣性分析

黨 輝，陳 佩

（1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2.陜西開放大學中瑞旅游與酒店管理學院，陜西 西安 710119）

醪糟又稱“甜酒”，是一種以糯米為主要原料發酵而成的傳統美食，其在我國陜西等地區自古就有釀造和食用的傳統[1]。禮泉醪糟作為醪糟的典型代表，源于漢而盛于唐，其釀造歷史悠久、口味香甜、酒香醇厚，被譽為“三秦第一家”[2]。醪糟在發酵基質和發酵條件上與米酒有異曲同工之妙，均可被稱為“酒釀”或“甜酒”，常被進行比較研究[3]。值得注意的是，醪糟和米酒的制作過程均有微生物參與[4]，且兩者發酵過程和品質形成與微生物之間存在緊密的聯系[5]。

近年來，國內越來越多的學者針對醪糟或米酒展開了一系列研究[6]。向凡舒等[7]利用湖北孝感和四川成都地方的米酒曲進行了米酒的發酵制作，并從米酒中分離鑒定出77 株乳酸菌，鑒定發現其主要隸屬于片球菌屬（Pediococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）等。王艷萍等[8]對荊州米酒中的微生物進行了分離純化，發現毛霉屬（Mucor）和酵母菌屬（Saccharomyces）是米酒發酵過程中的優勢菌屬。但上述結論受限于純培養的制約，僅能對環境樣本中極少量的微生物進行鑒定[9]。而隨著測序技術的發展和測序成本的迅速降低，人們越來越傾向于通過測序技術對傳統發酵食品中微生物群落結構進行探究[10]。Wang Chunxiao等[11]通過測序技術發現不同米酒曲中的真菌構成存在較大差異，但整體來說均以根霉菌屬（Rhizopus）和Saccharomyces為主；向凡舒等[12]通過對宣恩米酒中微生物多樣性進行解析發現其主要以Pediococcus為主，其次依次是芽孢桿菌（Bacillus）和Lactobacillus等。禮泉醪糟作為西北地區一項傳統的發酵美食，蘊含著豐富的微生物資源，但卻少有研究對其微生物資源進行解析和收集，這可能導致微生物資源的大量丟失。

本研究以陜西咸陽禮泉的10 份農家自制醪糟為研究對象，使用高通量測序技術對其細菌和真菌多樣性進行解析，并結合PICRUSt和BugBase等生物信息學軟件對醪糟中細菌的功能和表型進行預測。通過本研究的開展，旨在為禮泉醪糟中微生物資源的搜集提供一定理論依據，并為禮泉醪糟的產業化提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醪糟 陜西省咸陽市禮泉縣的農戶。

DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；dNTPs Mix、5×TransStartTMFastPfuBuffer、FastPfuFly DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司；DNA 1000試劑盒 美國Agilent公司。

1.2 儀器與設備

ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司；R950機架式服務器 美國Dell公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 醪糟樣品的采集

從陜西省咸陽市禮泉縣的農戶家中共收集10 份農家自制的醪糟樣本（編號LQ1～LQ10）。所有醪糟樣本均以糯米為原料，接種自家自制酒曲，于28 ℃左右發酵2 d左右而成。采用無菌勺將醪糟攪拌均勻后挖取100 g左右裝入無菌無酶的離心管中，封蓋后置于低溫保藏箱中運回實驗室，于-80 ℃冰箱中貯存備用。

1.3.2 醪糟樣品中宏基因組DNA的提取、擴增和測序

稱取3 g左右醪糟樣本于滅菌的研缽中，充分研磨至糊狀。使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，對研磨后醪糟樣本中微生物的宏基因組DNA進行提取，并使用微量紫外分光光度計對DNA濃度和純度進行檢驗，將提取合格的DNA（OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0）貯存至-20 ℃備用。

使用帶有7 個堿基核苷酸標簽（barcode）的ITS3F/ITS4R和338F/806R引物，參照文獻中聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增條件和體系對真菌ITS區和細菌16S rRNA V3～V4區進行PCR擴增[13-14]，使用微量紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物的濃度和純度進行檢測。最后，將檢驗合格的擴增產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，使用Illumina MiSeq PE300平臺進行高通量測序。

1.3.3 生物信息學分析

根據雙端序列的重疊區域對下機序列進行拼接和質控，并基于barcode信息將每條序列分配到不同樣本中以得到高質量的測序數據集[15]。本研究基于QIIME（v1.75）平臺對醪糟樣本中微生物構成和多樣性進行解析。首先，參照Yang Chengcong等[9]奶酪中細菌多樣性的分析步驟對醪糟樣本中細菌構成和多樣性進行分析，接著參照王玉榮等[16]鲊廣椒中真菌多樣性的分析步驟對醪糟樣本中真菌構成和多樣性進行分析。本研究將不同數據庫與代表性序列進行了同源性比對[17-18]，通過Chao1指數和Shannon指數對醪糟中微生物的豐富度和多樣性進行評估，并基于Bray-Curtis距離的主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）對醪糟樣品中微生物的整體結構進行分析。

依據Greengene數據庫對高質量的16S rRNA序列進行聚類和注釋，使用PICRUSt軟件對禮泉醪糟樣品中細菌的基因功能進行預測，并參照蛋白質直系同源簇數據庫進行功能注釋[19]。將對構建的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和分組文件上傳在線網站進行細菌表型預測（https://bugbase.cs.umn.edu/）[20]。

1.4 多元統計學分析

基于Bray-Curtis距離對醪糟樣本中微生物群落的整體結構進行PCoA；基于Procrustes分析對醪糟樣品中細菌和真菌的一致性進行研究；使用Wilcoxon test對α多樣性指數、優勢菌群、細菌功能和表型之間的差異性進行檢驗；對優勢菌屬之間的Spearman相關性進行分析。所用分析和可視化均使用R軟件完成。

2 結果與分析

2.1 醪糟中微生物多樣性分析

PCoA作為一種非約束性的數據降維方法，常被用來研究樣本中微生物群落的差異性或相似性。本研究基于Bray-Curtis距離對醪糟中微生物差異性進行了分析，結果如圖1所示。

圖1 基于Bray-Curtis距離的PCoA（A）和Procrustes分析（B）Fig.1 Principal coordinate analysis (A) and Procrustes analysis (B) based on Bray-Curtis distance

由圖1A可知，PC1的貢獻率為40.75%，而PC2的貢獻率為35.06%，兩者累計貢獻率為75.81%。由此可見，前2 個PC能夠代表不同樣本間群落結構的大部分差異。同時，不同農戶家中自制的醪糟在空間分布上呈現出一定的分離和聚類趨勢。因此，本研究以PC1為分組依據將10 份醪糟分為兩組，其中LQ1、LQ2、LQ3、LQ9和LQ10隸屬于A組，而其他樣本則隸屬于B組。通過Procrustes分析對醪糟樣本中細菌和真菌的一致性進行分析發現（圖1B），禮泉醪糟中的細菌群落結構與真菌群落結構之間不具有顯著一致性（P=0.40）。由此說明，醪糟樣本中的細菌和真菌可能相互影響較小。基于Bray-Curtis距離兩組樣品細菌和真菌群落結構的差異性分析如圖2所示。

圖2 基于Bray-Curtis距離細菌（A）和真菌（B）的PCoAFig.2 Principal coordinate analysis of bacterial (A) and fungal (B) communities based on Bray-Curtis distance

由圖2A可知，隸屬于A組的醪糟在4 個象限均有分布，而隸屬于B組的醪糟樣本則分布在第2、3和4象限，且隸屬于兩組的醪糟樣本在空間上存在較大重合區域。由此可見，隸屬于不同分組醪糟中細菌的群落結構無明顯差異。由圖2B可知，隸屬于A組的醪糟全部位于Y軸正方向，而隸屬于B組的醪糟則全部位于Y軸負方向，兩組醪糟在空間上具有明顯分離趨勢，這也表明隸屬于不同分組醪糟中真菌的群落結構存在明顯差異。綜上所述，真菌可能是造成醪糟中微生物群落整體結構差異較大的原因之一。在對醪糟中微生物群落結構進行解析的基礎上，本研究進一步對不同分組中微生物的α多樣性進行了比較分析，其α多樣性指數的比較箱型圖如圖3所示。

由圖3可知，A組醪糟中細菌的Chao1指數與B組無顯著差異（P＞0.05），而Shannon指數卻顯著高于B組（P＜0.05）；但A組醪糟中真菌的Chao1指數顯著高于B組（P＜0.05），而Shannon指數與B組無顯著差異（P＞0.05）。Chao1指數常被用來評估環境中微生物群落的豐富度，而Shannon指數則常被用來評估環境中微生物群落的均勻度。由此可見，A組醪糟中細菌的豐富度與B組無顯著差異（P＞0.05），但其細菌均勻度卻顯著高于B組（P＜0.05）；而在真菌上則呈現相反的趨勢。

2.2 醪糟中微生物構成分析

在對醪糟中微生物多樣性進行分析的基礎上，本研究進一步對醪糟中優勢菌門和優勢菌屬（平均相對豐度大于1%）進行了比較分析[16]，其結果如表1所示。

表1 醪糟中優勢菌門和菌屬的比較分析Table 1 Comparative analysis of dominant microbial phyla and genera in Laozao

由表1可知，禮泉醪糟中的優勢細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），平均相對豐度分別為97.20%和2.29%，其累計平均相對豐度高達99.49%；而優勢細菌屬有5 個，其分別為Lactobacillus（85.25%）、Pediococcus（5.50%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，1.68%）、鏈球菌屬（Streptococcus，1.63%）和乳球菌屬（Lactococcus，1.12%）。由表1 亦可知，禮泉醪糟中的優勢真菌門為毛霉菌門（Mucoromycota）和子囊菌門（Ascomycota），平均相對含量分別為56.90%和43.10%，其累計平均相對豐度高達99.99%；而優勢真菌屬有4 個，其分別為Rhizopus（56.66%）、Saccharomyces（23.28%）、覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis，12.24%）和假絲酵母屬（Candida，5.35%）。經Wilcoxon檢驗發現，Pediococcus、Mucoromycota和Rhizopus在A組醪糟中的相對豐度顯著高于B組，而Ascomycota則呈現相反的趨勢。由此可見，醪糟中真菌的組間差異明顯大于細菌。在此基礎上，本研究進一步對醪糟中微生物的相關關系進行了分析，其結果如圖4所示。

圖4 醪糟中優勢菌屬的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of dominant microbial genera in Laozao

由圖4可知，醪糟樣本中微生物之間相關性關系整體較弱，其中Lactobacillus和Saccharomycopsis，以及Leuconostoc和Lactococcus之間呈顯著正相關（r＞0.5，P＜0.05），而Streptococcus和Saccharomycopsis之間呈顯著負相關（r＜-0.5，P＜0.05）。而值得注意的是，細菌內部之間大多呈正相關，真菌內部之間無顯著相關性，而細菌和真菌之間呈負相關。

2.3 功能和表型預測

隨著生物信息學技術的快速發展，科研人員可以通過高通量測序數據對環境樣本中細菌的功能和表型進行預測分析。本研究首先使用PICRUSt軟件對醪糟中細菌的功能基因進行預測，并基于直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）數據庫對其進行注釋。醪糟中細菌功能類別的比較分析如圖5所示。

圖5 醪糟中細菌功能類別的比較分析Fig.5 Comparative analysis of bacterial functional genes in Laozao

本研究從禮泉醪糟細菌中共注釋到4021 個COG，其分別隸屬于23 個一級功能層。由圖5可知，一級功能層中氨基酸轉運與代謝，復制、重組和修復在A組醪糟中相對表達量顯著低于B組（P＜0.05），而轉錄在A組醪糟中相對表達量顯著低于B組（P＜0.05）。而值得注意的是，翻譯、核糖體結構與生物發生在醪糟中具有較高表達量。同時，本研究使用BugBase在線網站對醪糟中細菌的表型進行了預測，其結果如圖6所示。

圖6 醪糟中細菌表型結果的比較分析Fig.6 Comparative analysis of bacterial phenotypic data in Laozao

由圖6可知，革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、可移動元件和潛在致病性在兩組中存在顯著差異（P＜0.05），其中革蘭氏陰性菌和潛在致病性在A組中顯著較高（P＜0.05），而革蘭氏陽性菌和可移動原件在A組中顯著較低（P＜0.05）。由此可見，A組和B組醪糟中細菌在表型上存在較大的差異。

討論

近年來，隨著食品工業的快速發展，越來越多的傳統發酵食品消失在大眾視野之中，而其中所蘊含的寶貴微生物資源也隨之消失。受限于傳統的微生物鑒定方法，在對傳統發酵食品中微生物構成和多樣性進行研究時，并不能準確揭示相關規律，這也使得相關人員無法準確解析傳統發酵食品的發酵機制。因此，本研究采集了10 份禮泉醪糟，并結合高通量測序技術對其微生物群落結構進行解析，以期為其安全性評估和工業化生產提供必要的理論支持，促進我國相關食品產業的發展。

禮泉醪糟通常以糯米為主要原料釀制而成，因而其中可能蘊含著較為獨特和多樣的乳酸菌和酵母菌[21]。高通量測序結果顯示禮泉醪糟中的細菌絕大部分隸屬于Firmicutes，且優勢細菌屬為Lactobacillus、Pediococcus、Leuconostoc、Streptococcus和Lactococcus，累計占比高達95.18%，且優勢菌屬均隸屬于乳酸菌。乳酸菌作為益生菌最大的來源庫之一[22]，其不僅能將糖類物質轉化為乳酸，賦予發酵食品特殊的風味，抑制雜菌和有害菌的生長，且對于宿主的機體健康具有重要的意義[23]。王文平等[24]研究發現南寧地區米酒曲中以Lactobacillus（占比62.03%）為主，而孝感地區米酒中則以Weissella（占比50.14%）為主。上述結果均與本研究存在一定差異，這也說明禮泉醪糟具有較為獨特的微生物群落結構，而制作環境可能是造成上述菌群差異的主要原因之一[25]。Lactobacillus作為醪糟發酵過程中的主要菌屬，不僅將糖類物質轉化為乳酸，其發酵過程還伴隨著乙酸、乙醇和二氧化氮等副產物的產生，賦予禮泉醪糟特殊的口感和風味。大量研究證實了隸屬于Lactobacillus的大量菌株在緩解機體炎癥和調節腸道菌群平衡等方面發揮著巨大作用[26-27]。在對醪糟中真菌多樣性進行研究時發現，其優勢真菌屬為Rhizopus、Saccharomyces、Saccharomycopsis和Candida，與大多數關于米酒中真菌多樣性研究結果一致[28]。相關研究已經證實Rhizopus在米酒發酵過程中對淀粉水解起重要作用[29]，而酵母菌在酒精產生中十分 重要[30]。由此可見，醪糟中微生物群落在醪糟發酵和品質形成過程中有重要意義。

通過對醪糟中微生物群落結構進行降維分析發現醪糟樣本可明顯劃分為兩個分組。進一步分析發現，兩組中細菌的菌群結構無顯著差異，但真菌的群落結構呈現出明顯分離趨勢，且通過對醪糟中優勢菌群的差異分析驗證了上述現象。由此可見，禮泉醪糟中細菌群落的整體結構較為相似，而真菌是造成微生物群落整體差異的主要因素。相關研究也證實了真菌可能在醪糟發酵過程中占據主導地位，而細菌則對于醪糟的品質形成有重要作用。通過基因功能預測發現A組中細菌具有較強氨基酸轉運與代謝能力，這可能會導致醪糟的整體品質存在較大差異[31]。通過表型預測發現A組中細菌的潛在致病性相對較高，究其原因可能與農家醪糟的制作環境有關。綜合采樣信息發現，隸屬于A組醪糟的制作環境較為開放，主要在陰暗的廚房中發酵而成，且發酵過程中較易受到各種雜菌和有害菌的污染。由此可見，改善傳統發酵食品制作環境，對產品安全性和優良菌株篩選具有重要意義。