Neurospora crassa LY03菌株在客家“紅菌豆渣”營養物質轉化中轉錄組及轉化產物分析

林標聲，陳冠羲，張清霽，林 彬，陳小紅,，黎 英,

（1.龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.龍巖學院生物科技與健康產品工程技術研究中心，預防獸醫學與 生物技術福建省高等學校重點實驗室，福建 龍巖 364012；3.龍巖市科技局農村與社會發展科，福建 龍巖 364000）

客家“紅菌豆渣”主產于福建省武平縣，是以豆渣為原料，經過霉制、發酵，分解出游離氨基酸，去除了豆腥味，加工制成的一種產品表面布滿橙紅色菌絲、風味獨特、口感鮮美，富含膳食纖維、蛋白質和氨基酸等營養成分的當地傳統美食[1]。但“紅菌豆渣”不易保存，只能在當地售賣，受到很多不可控的非人為因素所制約，如不能有雜菌的出現、不能密封保存等。紅菌只能在自然環境下生長，一旦裝入瓶中，即失去鮮活的“生命”，成為死菌就不能食用[2]。此外，到目前為止，有關“紅菌豆渣”在發酵過程中營養物質轉化及代謝機制的科學研究較少，成為“紅菌豆渣”提高產量、質量，走向標準化、工業化生產的重要制約因素。因此，對“紅菌豆渣”微生物發酵特性、主要營養成分的變化及發酵機理機制等亟待進一步深入分析。

本團隊前期采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基從“紅菌豆渣”中已分離得到其主要的發酵菌株LY03，通過形態學觀察、18S rDNA鑒定、重測序及框架圖測序，已確定其為Neurospora crassa[3]。此外，研究還發現，Neurospora crassaLY03菌株基因組中存在著豐富的纖維酶基因（cellulase），該基因的轉錄表達對纖維構成為主的豆渣發酵及營養成分的轉化具有重要的意義[4-5]。因而，本研究在不同發酵時間“紅菌豆渣”營養成分分析的基礎上，進一步采用RNA-seq轉錄組學測序[6]、實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術[7]、超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）非靶標代謝組學[8]等現代生物技術尋找影響菌株發酵的主要差異表達基因、關鍵代謝物和代謝通路，探究cellulase基因的轉錄表達，對“紅菌豆渣”的發酵特性進行深入分析，以獲得科學、量化的數據，為提高“紅菌豆渣”發酵轉化效率及探究其營養成分轉化的分子機理提供理論基礎，使“紅菌豆渣”這一具有地方特色的發酵食品得到更為廣泛的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣 市購；Neurospora crassaLY03菌株由龍巖學院生命科學學院微生物發酵科研室分離，并于中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏（保藏號：CGMCC3.19233）。

真菌總RNA提取試劑盒 美國Omega公司；反轉錄試劑盒、Real time PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker 日本TaKaRa公司；引物由北京奧維森基因科技有限公司合成；雙縮脲、酪蛋白、石油醚、硼酸、苯酚、冰醋酸等均為國產分析純；甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水等為色譜級。

1.2 儀器與設備

LDZF-30L-I高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；XMTD-8222電熱恒溫鼓風干燥箱 上海金宏實驗設備有限公司；NanoDrop 2000分光光度計、Vanquish超高效液相色譜儀、Q Exactive HFX高分辨質譜儀 美國Therno Scientific公司；Tanon 1600凝膠成像系統 上海 天能科技有限公司；ABI7500熒光定量PCR儀 美國 Applied Biosystems公司；JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同發酵時間“紅菌豆渣”產品的營養成分分析

新豆渣炒熟冷卻至40 ℃；裝盒壓緊；按0.1%量撒Neurospora crassaLY03菌種孢子粉混勻，28 ℃培養，分別收集未接種的豆渣及發酵1、2、3 d和4 d（d1、d2、d3、d4表示，下同）的培養產品樣本各3 份進行營養成分的分析。其中水分含量的測定采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；纖維素含量的測定參照GB 29946—2013《食品添加劑 纖維素》；蛋白質含量測定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》；總糖含量的測定參照蒽酮法；脂肪含量測定采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；灰分含量測定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》；總酸含量測定參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》。

1.3.2 不同發酵時間“紅菌豆渣”菌株總RNA樣本的提取及轉錄組測序分析

收集發酵d1、d2、d3和d4不同時間“紅菌豆渣”菌絲生長樣本各3 份，混合均勻后采用真菌總RNA提取試劑盒提取各樣本總RNA，通過NanoDrop和Agilent 2100檢測RNA純度（OD260/280、OD260/230）及RNA片段長度，各樣本檢測合格后委托北京奧維森基因科技有限公司完成文庫的構建和測序工作，建好的測序文庫采用Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺進行轉錄組測序。去除測序接頭和低質量序列數據過濾原始數據后，采用star軟件將測序序列和轉錄組序列進行比對，隨后采用Cufflinks軟件組裝比對結果，對測序結果進行RNA-seq相關性檢查。采用HTSeq軟件對各樣本進行基因表達水平的分析，使用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）值為1作為判斷基因是否表達的闕值，只分析FPKM＞1的基因）[9]，并使用DESeq進行差異表達分析，篩選條件為q值小于0.05[10]。通過GOseq軟件對差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行基因功能（gene ontology，GO）富集分析[11]，將測序結果與京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫比對進行通路顯著性富集分析，對差異表達基因進行功能注釋和分類[12]。

1.3.3 不同發酵時間“紅菌豆渣”菌株cellulose基因的real-time PCR分析

將上述研究中經檢測合格并定量的不同發酵時間“紅菌豆渣”菌株總RNA樣本各取1.0 μg用于反轉錄成cDNA，操作按試劑盒說明進行。反轉錄總體系20 μL，其中Master Mix 10 μL（包括5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、Total RNA 1.0 μg，RNase-free H2O補至10 μL）、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer24.0 μL、RNase-free H2O 4.0 μL。將各樣本的反轉錄產物作為模板，設計cellulose（目的基因）及18S（內參）兩對引物分別做PCR。

引物序列分別為：cellulose-F ：5′-ATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG-3′；cellulose-R：5′-TCATATACTAATGCCCATCACAG-3′；18SF：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′；18S-R：5′-TTCCCCGTTACCCGTTG-3′。

PCR 反應總體系18 μL，其中2×Master Mix 10.0 μL、Primer F（10 μmol/L）0.5 μL、Primer R（10 μmol/L）0.5 μL，加水至總體積18 μL。將18 μL混合液加到96-PCR板對應的每個孔中，再加入對應的反轉錄成各樣本cDNA 2.0 μL，短暫離心混合后置于冰上，real-time PCR儀上進行PCR反應，按以下程序進行：95 ℃，30 s；40 個PCR循環（95 ℃，5 s；60 ℃，40 s（收集熒光））。建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應按如下溫度、時間進行：95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s）；并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃（儀器自動進行Ramp Rate為0.05 ℃/s）。選取cDNA樣本模板進行10 倍梯度稀釋，各5 個梯度，每個樣本檢測3 個復孔，各樣本的目的基因（cellulose）和內參（18S）分別進行real-time PCR反應，反應結束后，保存擴增曲線、溶解曲線及對應循環閾值（cycle threshold，Ct）[13]。數據采用2-ΔΔCt法進行分析，計算公式為：ΔCt=Ctcellulose基因-C t18S內參基因；ΔΔ Ct=Δ Ct不同發酵時間菌株樣本的cellulose基因-ΔCt發酵1d菌株樣本的cellulose基因，本實驗選定發酵d1作為對照；2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量，即不同發酵時間菌株樣本的cellulose基因相對于發酵d1的cellulose基因變化的倍數。測定值Ct≥2作為高表達的標準[14]。同時將所得real-time PCR結果與轉錄組測序結果按相同相對表達量計算方式換算后進行對比分析，驗證cellulose基因在轉錄組測序結果中的可靠性[15]。

1.3.4 不同發酵時間“紅菌豆渣”產品的代謝物的提取及UPLC-MS/MS分析

分別收集未接種的豆渣及接種后發酵d1、d2、d3和d4不同時間的“紅菌豆渣”產品樣本各3 份，混合均勻后，每份產品樣本取50 mg放入1.5 mL EP管中，加入1000 μL提取液（甲醇-乙腈-水，2∶2∶1，V/V，含同位素標記內標混合物）提取。提取樣本經研磨儀35 Hz下研磨處理4 min，再超聲處理5 min（冰水浴），重復3 次；然后樣本放入-40 ℃靜置1 h，再采用12000 r/min高速離心機離心15 min，將離心后上清液置于LC-MS/MS進樣瓶中進行上機檢測。所有樣本另取等量上清液混合成質控樣本上機檢測。

進行UPLC-MS/MS分析，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）對目標化合物進行色譜分離。流動相A為水，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水（pH 9.75），B相為乙腈[16]。采用梯度洗脫：0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～7 min，5%～35% A、95%～65% B；7～8 min，35%～60% A、65%～40% B；8～9 min，60% A、40% B；9～9.1 min，60%～5% A，40%～95% B；9.1～12 min，5% A、95% B。流動相流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，樣本盤溫度4 ℃，進樣體積3 μL。

質譜儀在控制軟件Xcalibur（Thermo）控制下進行一級、二級質譜數據采集，Xcalibur軟件持續評估全掃描MS光譜。電噴霧離子源；鞘氣流速30 arb，輔助氣流速25 arb，毛細管溫度350 ℃，全MS分辨率60000，MS/MS分辨率7500，碰撞能量歸一化模式下的碰撞能量為10、30、60 eV，離子源噴射電壓3.6 kV（正）或-3.2 kV（負）。

UPLC-MS/MS分析獲得的原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包（內核為XCMS）進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋[17]。根據所得注釋結果，利用MetaboAnalyst和KEGG在線分析軟件對所獲得代謝產物的不同代謝途徑進行分析，揭示Neurospora crassaLY03菌株在不同發酵時間“紅菌豆渣”產品營養物質生成的轉化機理[18]。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間“紅菌豆渣”產品營養成分分析

如圖1所示，發酵d1，菌絲緩慢生長，豆渣表面開始出現少量菌絲；發酵d2，菌絲開始大量生長，產品表面已布滿橙紅色菌絲，還出現了少量孢子粉；發酵d3，產生大量孢子粉；發酵d4，菌絲開始老化，顏色變深。

圖1 不同發酵時間“紅菌豆渣”產品Fig.1 Hongjundouzha with different fermentation times

如表1所示，未接種豆渣中主要成分為碳水化合物（纖維素、淀粉和多糖）和蛋白質，接種菌株發酵后各營養成分發生了明顯的變化，其中水分含量先降低后增加，纖維素、總糖含量明顯下降，蛋白質、脂肪、灰分、總酸含量明顯增加，且發酵后產品各營養成分含量均與發酵前差異顯著（P＜0.05）。研究表明，菌絲在生長過程中，大量利用豆渣原料中的碳水化合物生成各種單糖，因而纖維、總糖含量降低；但相對而言，菌株利用蛋白能力較弱，蛋白質分解較少，蛋白相對含量增加。同時，隨著發酵的進行，豆渣中的一些營養物質被分解利用生成了醇類物質、游離氨基酸、脂肪酸和有機酸等，這些醇類物質與酸性物質再通過酯化反應生成脂類物質，造成了產品中脂肪含量、有機酸含量明顯增加。此外，發酵過程中菌株生長消耗原料中的有機物質，干物質含量降低，因而灰分所占比例增加。研究還發現，總體上發酵d2各項營養指標與發酵前、發酵d1差異顯著（P＜0.05），而與發酵后d2、d3差異不太顯著，表明發酵d2可能是“紅菌豆渣”營養物質轉化的關鍵時期。

表1 不同發酵時間“紅菌豆渣”產品營養成分測定Table 1 Nutritional components of Hongjundouzha with different fermentation times

2.2 Neurospora crassa LY03菌株在“紅菌豆渣”不同發酵時間轉錄組分析

2.2.1 不同發酵時間“紅菌豆渣”菌絲總RNA提取及檢測

不同發酵時間“紅菌豆渣”菌絲收集獲得的各樣本總RNA提取質量較好，其OD260/280為2.021～2.157，OD260/230為1.2～2.316，RNA為140～562 ng/μL，樣本質量滿足建庫測序要求。RNA樣本反轉錄成cDNA，將構建好的cDNA文庫，通過Illumina HiSeqTM4000測序平臺進行轉錄組測序。測序得到的下機數據去除帶有接頭（adapter）、N（不確定堿基）含量不小于10%和低質量堿基（Q≤20）含量超過50%的reads，得到分析數據。12 個樣本均獲得了5.0 G以上容量的原始數據，鳥嘌呤-胞嘧啶（guanine-cytosine，GC）含量占比都在54%以上，平均錯誤率均為0.03%，Q20與Q30分別在97%及91%以上（表2），表明轉錄組測序所獲數據的質量較好，可用于后續分析。兩樣本之間的相關系數（R2）大于0.80，表明結果可靠且樣本選擇合理（圖2）。

表2 各樣本測序數據統計及質量檢驗結果Table 2 Sequencing data and quality test results of each sample

2.2.2 DEGs篩選

對基因表達量進行表轉化處理后，根據|log2FC|大于1且q值小于0.05的原則篩選DEGs。d2 vs.d1篩選出2814 個DEGs（圖3a），有1254 個基因上調表達（包括cellulose基因，ID1007），占總差異表達44.56%；1560 個基因下調表達，占總差異表達55.44%。d3 vs.d2篩選出69 個DEGs（圖3b），有57 個基因上調表達，占總差異表達82.61%；12 個基因下調表達（包括cellulose基因），占總差異表達17.39%。d4 vs.d3篩選出1034 個DEGs（圖3c），有649 個基因上調表達，占總差異表達62.77%；385 個基因下調表達（包括cellulose基因），占總差異表達37.23%。結果表明d2菌株大量生長、基因表達活躍，與d1差異較大；d3相對于d2差異變化不大；d4與d3差異又增加，表明d4菌株開始老化，基因表達差異明顯。以FPKM＞1作為判斷基因表達的標準，4 個樣本共獲得16 個共同表達基因，d2 vs.d1特有表達基因2379 個，d3 vs.d2特有表達基因20 個，d4 vs.d3特有表達基因612 個（圖3d），進一步驗證了豆渣發酵菌群功能發生明顯變化主要在發酵d2。

圖3 4 組樣本DEGs火山圖和Venn圖Fig.3 Volcano pot and Venn diagram of DEGs among four groups of samples

2.2.3 上調DEGs的KEEG富集

根據上調差異表達基因KEEG富集分析，分別對富集最顯著的20 條KEGG代謝通路分析，富集差異表達基因富集數目最多的信號通路均為“次生代謝物的生物合成”（圖4）。其中，d2 vs.d1中，“碳代謝和淀粉和蔗糖代謝”DEGs的富集最顯著（P＜0.05），表明d2為菌體進行糖類代謝的主要階段（圖4a）。d3 vs.d2中，主要富集到各類的氨基酸代謝，包括“組氨酸代謝”、“色氨酸代謝”、“β-丙氨酸代謝”、“酪氨酸代謝”、“精氨酸和脯氨酸代謝”、“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解”、“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”和“氨基酸生物合成”，表明d3為菌體進行各類氨基酸代謝的主要階段（圖4b）。d4 vs.d3中，DEGs富集顯著的代謝途徑是“氧化磷酸化”、“淀粉和蔗糖代謝/過氧化物酶體”和“次生代謝物的生物合成”，表明d4菌絲體老化變色可能與其產生的氧化酶類及淀粉代謝生成的深色物質有關[19]，該階段生成了大量的次生代謝產物（圖4c）。

圖4 上調DEGs的KEGG功能歸類Fig.4 KEGG functional classification of up-regulated DEGs

2.3 Neurospora crassa LY03菌株在 “紅菌豆渣”不同發酵時間cellulose基因的表達分析

1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗表明12 個樣本總RNA提取質量較高，12 個樣本cellulose基因的real-time PCR的表達水平分析表明，各樣本溶解曲線均為單一尖銳峰，表明各擴增產物單一、穩定、復性較好，結果較為準確可靠。cellulose基因與18S基因的real-time PCR擴增效率測定表明，目標基因cellulose和內參基因18S擴增效率一致，實驗結果可應用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。結果表明，不同發酵時間樣本的cellulose基因在轉錄水平上的表達2-ΔΔCt值分別為d11.00、d23.46、d32.15、d40.19（圖5），cellulose基因的表達呈現出先增加后下降的趨勢。其中，d2和d3cellulose基因的相對表達量均達到過表達水平（≥2），且均與d1相比差異達到顯著水平（P＜0.05）。此外，cellulose基因real-time PCR測定的變化趨勢與轉錄組測序結果一致，表明轉錄組篩選出的DEGs具有可靠性。

圖5 不同發酵時間cellulose基因的相對表達量分析Fig.5 Analysis of relative expression of cellulose at different fermentation time

2.4 Neurospora crassa LY03菌株在“紅菌豆渣”不同發酵時間轉化產物分析

2.4.1 “紅菌豆渣”不同發酵時間產品代謝物的聚類分析

將“紅菌豆渣”未接種豆渣及接種后不同發酵時間共15 個產品樣本通過UPLC-MS/MS平臺進行分析檢測到1910 個代謝物。主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）分析[20]結果基本一致（圖6）。d2、d3和d4樣本能更好地聚類在一起，與d0和d1差異較大。

圖6 不同發酵時間樣本的PCA（a）和OPLS分析（b）圖Fig.6 PCA (a) and OPLS analysis (b) of samples at different fermentation times

2.4.2 “紅菌豆渣”不同發酵時間產品代謝物的差異化合物熱圖分析

將不同發酵時間產品的差異代謝化合物前60 位（變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）大于1，P＜0.05）進行熱圖聚類分析（圖7）[21]，結果表明所篩選出的差異化合物主要可分為糖和糖醇、氨基酸、有機酸以及其他代謝物4 大類，其中糖和糖醇類14 個，隨著發酵時間的延長，樣品中相對含量最高的三乙酸纖維素和纖維二糖逐漸下降，D-阿拉伯糖、山梨醇、D-木糖和L-巖藻糖相對含量逐漸上升再下降，總體上主要糖醇類相對含量變化發生在d2。氨基酸類13 個，隨著發酵時間的延長，大部分氨基酸的相對含量明顯上升，其中d3為各氨基酸相對含量明顯增長的時期，d4氨基酸含量開始降低。有機酸類16 個，總體上發酵前期d1～d3各類有機酸相對含量均較高，發現許多具有保健作用的有機酸如蘋果酸、綠原酸、亞油酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、4-羥基丁酸等，但隨著發酵時間的延長，d4有機酸的相對含量降低。在其他代謝物類17 個，隨著發酵的進行，豆渣中原有的糖苷類化合物、黃酮類化合物如大豆苷、6-染料木苷、染料木素等分解轉化成新橙皮苷、番木鱉堿、尿囊素、十四酸乙酯、溶血磷脂酰膽堿（18:4/18:1）、溶血磷脂酰膽堿（18:1）、次黃嘌呤、角鯊烯、2-羥基腺嘌呤等具有特殊生理活性的物質，總體上d4是各次生代謝物生成的主要時期。

圖7 不同發酵時間差異代謝物相對含量的熱圖Fig.7 Heatmap of relative contents of differential metabolites at different fermentation times

2.5 Neurospora crassa LY03菌株在“紅菌豆渣”不同發酵時間轉錄組與轉化產物關聯分析

通過KEGG富集分析，把轉錄組、轉化產物分析共同富集到的通路進行整理歸納，挑選出共同富集通路的前10[22]。結果表明，發酵前期d2關鍵基因和代謝物主要富集在“淀粉和蔗糖代謝”、“碳代謝”和“代謝途徑”（圖8a），表明該階段主要進行糖類的代謝；d3主要進行氨基酸和有機酸的代謝，關鍵基因和代謝物主要富集在“氨基酸生物合成”、“檸檬酸循環”和“丙酮酸代謝”（圖8b）；d4關鍵基因和代謝物主要富集在“次生代謝物的生物合成”和“氨基酸生物合成”，表明該階段主要進行氨基酸和一些次生代謝物的合成（圖8c）。

圖8 基因與代謝物共同參與數最多的前10 個代謝通路Fig.8 Top 10 pathways with the largest number of genes and metabolites involved together

3 討論

研究不同發酵時間“紅菌豆渣”產品的營養成分，并對其進行轉錄組測序和轉化產物分析，結果表明“紅菌豆渣”發酵后其營養成分發生了明顯的變化，豆渣原料中的碳水化合物、蛋白等成分轉化成了糖類、醇類物質、脂肪酸、有機酸和游離氨基酸等，其中發酵2 d是“紅菌豆渣”營養物質轉化的關鍵時期。轉錄組測序及real-time PCR分析表明，d2基因表達最活躍，主要進行糖類代謝，其中DEGcellulase表達最為活躍；d3主要進行氨基酸代謝；d4主要進行次生代謝產物的生成。轉化產物分析表明，d0、d1與d2、d3、d4樣品差異較大，而d2、d3和d4樣本可以較好地聚類在一起。總體上，d2生成糖醇類和有機酸類化合物，d3生成氨基酸和有機酸，d4生成次生代謝產物及部分氨基酸，另外還生成氧化酶類產生深色物質促使“紅菌豆渣”菌絲老化。轉錄組與轉化產物關聯分析表明，轉錄組、轉化產物分析共同富集通路主要是“淀粉和蔗糖代謝”、“碳代謝”、“氨基酸生物合成”和“丙酮酸代謝”。

“紅菌豆渣”發酵的主要原料為豆渣，其主要成分為碳水化合物（纖維素、淀粉、多糖等）和蛋白質[23]。Neurospora crassa菌株是優良的纖維素酶產生菌，本研究證實，豆渣接種Neurospora crassa進行發酵，能對豆渣原料中的纖維素進行較好地分解，產物為葡萄糖，其中cellulase基因的表達起了重要的作用。real-time PCR測定表明cellulose基因的表達呈現先增加后下降的趨勢，其表達量變化趨勢與樣品中纖維素成分的分解變化及轉錄組測序結果一致。豆渣中淀粉分解產物為葡萄糖，而多糖則主要為水溶性、非淀粉還原性多糖[24-25]，經“淀粉和蔗糖代謝”、“碳代謝”途徑代謝后分解成葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、巖藻糖等單糖。豆渣中碳水化合物還有糖醇和寡糖，經代謝后分解成山梨醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇。各種糖類和糖醇類物質再進行“檸檬酸循環”、“丙酮酸代謝”、“次生代謝物的生物合成”生成多種具有保健作用的有機酸，如用于貧血癥、尿毒癥、高血壓等多種疾病治療的蘋果酸；具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降“三高”、清除自由基及增香、護色、防腐功效的綠原酸[26]；大多數人需要補充的多不飽和脂肪酸亞油酸、γ-亞麻酸和γ-花生四烯酸；具有預防老年癡呆癥發生、改善神經機能、抗衰老、減肥、改善脂質代謝等功效的4-羥基丁酸（又稱γ-羥基丁酸）[27]。豆渣中蛋白質通過“氨基酸生物合成”途徑分解生成了谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸等各類氨基酸。此外，豆渣原料中原有的大豆苷、染料木苷、染料木素等成分通過“次生代謝物的生物合成”途徑生成一些具有特殊生理功能的活性物質，如具有降血脂、降血糖作用的天然 黃酮化合物新橙皮苷[28]；具有提高體內超氧化物歧化酶活性、增強機體的免疫能力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功效的角鯊烯[29]及天然神經毒素番木鱉堿[30]等，但同時也生成了一些指示食品腐敗的油脂溶血磷脂酰膽堿（18:4/18:1）和溶血磷脂酰膽堿（18:1）[31]。

4 結論

“紅菌豆渣”接種Neurospora crassa菌株進行發酵，發酵2 d，菌絲生長旺盛，豆渣原料中的碳水化合物、蛋白質等營養物質轉化強烈，cellulase基因的表達起了重要的作用；發酵3 d，營養物質轉化基本平穩，糖醇、氨基酸、脂類等風味物質生成，產品發酵成熟；發酵4 d，菌絲開始老化，產生了一些具有特殊功能的生理活性物質，但同時產品開始出現腐敗。本研究從分子水平上全面分析“紅菌豆渣”營養物質轉化的機制，可為提高“紅菌豆渣”的發酵效率，提升產品品質，促進其產品精深加工和高值化利用提供理論基礎。