細胞焦亡在新生兒缺氧缺血性腦病中的研究進展

黃潤芝 曹長青 李宇寧

1.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫院兒科，甘肅蘭州 730000

缺氧缺血性腦病是新生兒常見的神經系統病變之一，圍生期窒息是其發病的主要原因[1]。在全球范圍內，每年大約有120 萬新生兒患者，是新生兒健康的重大威脅。新生兒缺氧缺血性腦病發病機制復雜，目前臨床上尚無特異性治療方法，部分患者療效不佳，并且存在不良的臨床結局，如腦癱、癲癇、發育異常、認知功能障礙等，嚴重者甚至導致死亡[1]。因此，研究探索新生兒缺氧缺血性腦病發生及發展的具體機制，為該病的預防及臨床治療提供靶點顯得十分重要。

細胞焦亡是近年來提出的一種全新的細胞死亡機制，它與傳統的細胞凋亡、細胞自噬性死亡及細胞壞死均不同[2]。20 世紀90 年代，科學家們首次在巨噬細胞中觀察到了細胞焦亡的現象[3]，然而，由于技術的限制，人們對其機制了解并不清楚。近年來，在眾多科學家們的努力下[4]（我國邵峰教授在細胞焦亡領域做出了巨大貢獻[5-7]），細胞焦亡的生物學過程逐漸被揭示：細胞焦亡是一種程序性細胞死亡，主要通過炎癥小體介導多種含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）（主要是caspase-1）的激活，進而引起GSDM 家族蛋白，特別是GSDMD 的剪切和多聚化，剪切后的GSDM 蛋白會轉位至細胞膜上，造成細胞穿孔，導致細胞的腫脹和死亡[2]。

細胞焦亡是機體重要的應激及免疫調節過程，在感染性疾病[8]、代謝性疾病[9]、腫瘤[10]及神經系統疾病[11]中扮演重要角色。越來越多的證據表明細胞焦亡與新生兒缺氧缺血性腦病存在密切聯系，本文主要圍繞細胞焦亡與新生兒缺氧缺血性腦病的關系展開系統綜述，以期為該病的臨床治療提供啟示。

1 細胞焦亡信號通路

細胞焦亡現象最初由Brennan 和Cookson 發現，他們觀察到傷寒沙門菌可以通過caspase-1 介導巨噬細胞死亡，該現象被命名為細胞焦亡[2]。細胞焦亡過程最顯著的特點為細胞膜受損形成孔洞，細胞腫脹破裂，進而釋放大量的炎癥細胞因子。研究表明，焦亡過程中細胞膜孔洞的形成是由GSDM 家族蛋白介導的。當GSDM 家族成員被蛋白酶切割，釋放N 端結構域后會轉位至細胞膜，在胞膜上形成孔洞，導致細胞膜通透性改變、細胞腫脹和細胞死亡[2,12]。

根據GSDM 蛋白激活方式的差異，細胞焦亡分為經典細胞焦亡通路、非經典細胞焦亡通路和caspase-3 介導的細胞焦亡通路[2]。經典細胞焦亡通路由caspase-1 介導，當細胞內的炎性復合物NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）感知到病原體信號后，會激活caspase-1，促進caspase-1 對GSDMD 的切割。切割后的N-GSDMD 蛋白隨后轉位至細胞膜上觸發細胞焦亡[13]。非經典的細胞焦亡通路由caspase-4/5/11 這3 種酶介導。在非典型細胞焦亡途徑中，活化的caspase-4/5/11 切割GSDMD 形成N-GSDMD，觸發細胞焦亡[14]。細胞中還存在caspase-3介導的細胞焦亡，caspase-3 是凋亡信號通路的重要環節，內源性和外源性凋亡均可以激活caspase-3。而活化的caspase-3 可以切割GSDME 生成N-GSDME，導致細胞焦亡[7]。近年來，隨著細胞焦亡的具體機制被逐漸揭開，細胞焦亡逐漸成為各個領域研究的熱點，人們也發現細胞焦亡在多個疾病中扮演重要作用，包括新生兒缺氧缺血性腦損傷，但是，其具體的作用機制及臨床意義仍需深入探索。

2 新生兒缺氧缺血性腦病與炎癥

缺氧缺血性腦損傷是新生兒死亡和長期神經功能障礙的主要原因，該病和致殘率和死亡率高，疾病負擔較重[15]。有確切的證據表明，神經炎癥反應是新生兒缺氧缺血性腦病的關鍵發病機制，各種原因引起的腦組織缺氧缺血可以觸發大腦中免疫細胞的強烈激活，進而觸發炎癥級聯反應[16]。

在所有引發缺氧缺血后神經炎癥的免疫細胞中，小膠質細胞扮演主要角色[17]。當受到缺氧缺血刺激后，小膠質細胞會產生并釋放一系列炎癥介質，如白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。研究顯示，小膠質細胞激活的分子機制多樣，細胞焦亡、Galectin-3信號通路、Notch 信號通路、Toll 樣受體信號通路等均參與到小膠質細胞的活化和炎癥因子的產生[17]。其中，細胞焦亡處于中心環節。多種上游信號均可與細胞焦亡相互作用，最終導致細胞膜孔洞的形成和炎癥因子的大量釋放。

因此，深入探索細胞焦亡在小膠質細胞中的激活過程，闡明細胞焦亡與新生兒缺氧缺血性腦病的關系是目前研究的熱點。

3 細胞焦亡與新生兒缺氧缺血性腦病

3.1 缺氧缺血與小膠質細胞焦亡

NOD 樣受體家族（NOD-like receptors，NLRs）是一種免疫系統的多蛋白復合物構成的細胞感受器，是人體內重要的炎癥反應傳感器和效應器之一，也是細胞焦亡通路激活的的關鍵環節。而NLRP3 是NLRs的家族成員之一，與凋亡相關的斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD，ASC）和caspase-1 組成炎癥小體，既往研究顯示，腦組織缺氧缺血后可以檢測到小膠質細胞中NLRP3 炎癥小體的激活[18]。在小鼠缺氧缺血性腦損傷模型中，損傷4 h后NLRP3 表達即顯著上調[19]。NLRP3 被缺氧及炎癥因素激活后，會進一步募集下游蛋白激活細胞焦亡通路，造成小膠質細胞細胞穿孔、死亡和炎癥的擴散。另外，NLRP3 的激活也可以調節小膠質細胞向M1 型極化狀態轉變，增強其促炎能力[20]。有學者在缺氧缺血性腦損傷動物模型中發現，使用紅景天苷抑制小膠質細胞中NLRP3 炎癥小體的激活可以顯著抑制小膠質細胞焦亡和周圍神經元損傷[21]。caspase-1/4/5/11 是細胞焦亡激活必不可少的蛋白酶，在腦損傷發生后，其表達量和活性會顯著升高[19]，促進細胞焦亡的發生。此外，細胞焦亡的效應蛋白GSDM 和效應產物IL-1β、IL-18 的表達水平在缺氧缺血性腦損傷也顯著增加[22]，這些結果提示，細胞焦亡深度參與了新生兒缺氧缺血性腦病的發生和發展。

3.2 缺氧缺血觸發細胞焦亡的分子機制

細胞焦亡在新生兒缺氧缺血性腦病的致病過程中扮演關鍵角色，進一步明確細胞焦亡的激活過程有助于增進對于該病的理解。目前多項研究針對缺氧缺血引起小膠質細胞焦亡的分子生物學機制展開了探索。

趨化因子是細胞因子的重要成員，是人體應激及應對感染的主要細胞因子的之一。Serdar 等[23]在新生小鼠缺氧缺血模型中發現，缺氧缺血發生24 h 內，腦組織小膠質細胞中的趨化因子C-X-C 基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）和趨化因子受體C-X-C 基序趨化因子受體2（C-X-C motif chemokine receptor 2，CXCR2）的轉錄表達即顯著上調；CXCL1 的表達上調可以通過作用于趨化因子受體CXCR2 進而激活整合素鏈接激酶（integrin-linked kinase，ILK），ILK 可以直接作用于NLPR3激活炎癥小體進而促進caspase-1 的活化[23]，最終誘導細胞焦亡的發生和炎癥因子的擴散。

氧化應激是新生兒缺氧缺血性腦病的關鍵致病因素，研究顯示，新生兒大腦由于多不飽和脂肪酸含量高、耗氧量高、游離鐵含量高等特點，對缺氧缺血極為敏感，表現為強烈的氧化應激反應[24]。氧化應激反應會導致小膠質細胞產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[24]，ROS 產生后，會通過觸發胞內硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）和硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）復合物的解離。隨后游離的TXNIP 與NLRP3 的LRR 區域結合，最終導致NLRP3 激活和細胞焦亡的發生。同時，ROS 產生也會通過Keap1/Nrf2 通路促進NLRP3 的構象轉變從而直接激活NLRP3[25]，進而介導細胞焦亡。

此外，TLR4/NF-κB 信號通路也在缺氧缺血后細胞焦亡激活的過程中扮演重要角色。TLR4 是Toll 樣受體家族的核心蛋白，主要表達于小膠質細胞，在啟動神經炎癥反應和介導神經免疫方面發揮關鍵作用。當缺氧缺血發生后，TLR4 可會被內源性（如纖連蛋白、熱休克蛋白等）或者外源性配體（如脂多糖）過度激活[26]，隨后以沉默髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴的方式促進炎癥因子的表達和NF-κB 信號通路的激活，最終轉錄性的活化NLRP3，觸發細胞焦亡。

總之，新生兒缺氧缺血發生后觸發細胞焦亡的機制多樣，與趨化因子、氧化應激反應及TLR4/NF-κB均有關聯，還有研究顯示，絲裂原活化蛋白激酶信號通路[27]及缺氧誘導因子-1α 信號通路[28]等也參與到缺氧缺血損傷后NLRP3 炎癥小體和細胞焦亡的激活。因此，細胞焦亡是新生兒缺氧缺血性腦病致損的下游信號通路和效應器，靶向細胞焦亡可以有效地減輕神經系統炎癥反應，是有臨床前景的治療手段之一。

3.3 細胞焦亡與新生兒缺氧缺血性腦病的治療

基于細胞焦亡在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的關鍵作用，人們已經開發出許多靶向焦亡通路的治療藥物。

在小鼠腦缺血模型中，使用NLRP3 抑制劑MCC950[29]和Bungeanum[30]抑制小膠質細胞焦亡可以顯著改善小鼠的認知功能。姜黃素治療可以通過調節TREM2/TLR4/NF-κB 通路減少NLRP3 的激活[18]，進而減少NLRP3 依賴性細胞焦亡來改善小鼠模型的臨床癥狀。此外，白藜蘆醇[31]、黃芩素[32]、槲皮素[33]和異甘草素[34]等天然藥物均被發現具有抑制NLRP3 炎癥小體的作用，有望為新生兒缺氧缺血性腦病的治療帶來益處。

人們還開發出一些靶向caspase 酶的治療藥物。AC-YVAD-CMK 是一種caspase-1 的選擇性抑制劑，被發現可抑制小膠質細胞焦亡并在小膠質細胞中誘導抗炎表型，從而改善缺氧缺血后腦損傷的癥狀[35]。另一種caspase-1 的抑制劑VX765 被證實也可以顯著抑制細胞焦亡和TLR4/NF-κB 信號通路，有助于減輕神經損傷[36]。芍藥苷等天然藥物可以通過抑制小膠質細胞中caspase-11 依賴性焦亡信號通路減弱神經炎癥反應[37]。

靶向細胞焦亡的效應器GSDMD 也是一種有效的抑制焦亡手段，靶向GSDMD 的策略有兩種：抑制其剪切或者抑制剪切后的N-GSDMD 蛋白。小分子藥物Mafenide 通過直接結合GSDMD-Asp275 位點抑制GSDMD 的剪切[38]，進而抑制巨噬細胞和小膠質細胞焦亡。此外，小分子藥物Sulfa-4 和Sulfa-22 也可以靶向GSDMD 的剪切，抑制細胞焦亡和炎癥因子釋放，顯著減輕神經炎癥的程度[39]。人們也發現，小分子藥物DMF 可以作為N 端GSDMD 蛋白的有效抑制劑，降低小膠質細胞焦亡和炎癥因子的釋放[40]，如IL-1和IL-18 等。值得注意的是，靶向細胞焦亡的藥物雖然比較多，但其基本都處于動物實驗或者臨床試驗階段，臨床應用層面尚無與細胞焦亡有關的新生兒缺氧缺血性腦病治療方案，相信隨著研究的深入和更多藥物開發手段的改進，未來必將探索出更多更為有效的抑制細胞焦亡的治療方法，也將為新生兒缺氧缺血性腦病的治療帶來曙光。

4 小結

新生兒缺氧缺血性腦病是新生兒常見的神經系統病變，也是嬰幼兒死亡和致殘的重要原因。多項研究顯示，作為炎癥激活和擴散的核心環節，細胞焦亡在新生兒缺氧缺血性腦病中扮演關鍵角色，靶向抑制細胞焦亡的治療策略也顯示出良好的緩解神經系統損傷的效果。此外，細胞焦亡受到多種因素的調控，如細胞凋亡、壞死性凋亡及細胞自噬等，深入研究缺氧缺血發生后細胞焦亡的激活過程和具體調控機制仍是基礎研究的熱點。目前，部分天然藥物已被證明具有抑制細胞焦亡的效果，天然藥物安全性較高，價格低廉，具有其獨特優勢，但其特異性不強，進一步發現特異性靶向細胞焦亡的藥物將是未來研究的重點方向。相信隨著細胞焦亡研究的深入，人們將加深對于新生兒缺氧缺血性腦病的理解，也將為該病的治療帶來新希望。